Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Двугибридная система > Выделение pDNA из дрожжей на колонках.

Выделение плазмидной ДНК из дрожжей на колонках.


Главная.
Новости.
О проекте.
Справочник.
Рестриктазы.
Методы.
Растворы.
Расчёты.
Обзоры.
Обучение.
Ссылки.
Скачать сайт.

Образовательные
ресурсы.

Растворы.
Tris/Сорбитол
I плазмидный раствор
II плазмидный раствор
Комментарии.
Общие.
По пунктам.
Быстрый метод выделения плазмидной ДНК из дрожжей на колонках для последующей трансформации E.coli или проведения PCR.

  1. Посеять одиночную колонию в 3ml селективной среды и растить не менее 20h при +30°С;
  2. 1.5ml ночной культуры поместить в 1.7ml пробирку, ЦФ 3', удалить супер;
  3. Суспендировать осадок в 300µl раствора "Tris/Сорбитол";
  4. Добавить 5 µl литиказы (10u/µl);
  5. 37°С, 1h, время от времени перемешивать;
  6. ЦФ 3', удалить супер;
  7. Суспендировать осадок в 50µl "I" плазмидного раствора;
  8. + 100µl "II" плазмидного раствора, ~3 раза перевернуть;
  9. 0oС, 5';
  10. + 50µl холодного 10М AcONH4, ~3 раза перевернуть;
  11. 0oС, 5';
  12. ЦФ 10', супер перенести в новую пробирку;
  13. К суперу добавить 800µl "Capture buffer"
  14. Поместить колонку в 2ml пробирку;
  15. Нанести на колонку 500µl из п.13, ЦФ 1';
  16. Нанести на колонку оставшиеся 500µl из п.13, ЦФ 1';
  17. Нанести на колонку 500µl "Wash buffer", ЦФ 1';
  18. Поместить колонку в чистую 1.5ml пробирку;
  19. Нанести на колонку 20-50µl 10mM Tris-HCl pH=8.0, инкубировать 2';
  20. ЦФ 20'', элюат перенести в новую пробирку.

    Растворы.

    "Tris/Сорбитол"

    Конц.Сток1ml10ml100ml
    Tris Cl, pH 8.050mM1M50µl0.5ml5ml
    Сорбитол1M2M500µl5ml50ml
    H2O mQ450µl4.5ml45ml

    "I плазмидный раствор"

    Конц.Сток50ml100ml1L
    Глюкоза50mM2M1.25ml2.5ml25ml
    Tris Cl, pH 8.025mM1M1.25ml2.5ml25ml
    EDTA10mM0.5M1.0ml2.0ml20ml
    H2O mQ46.5ml93ml930ml

    "II плазмидный раствор"

    Конц.Сток1ml10ml100ml
    NaOH0.2N1N0.2ml2ml20ml
    SDS1%10%0.1ml1ml10ml
    H2O mQ0.7ml7ml70ml


    Комментарии.

    Общие.

  • Плазмидная ДНК, выделенная этим методом, не имеет особого загрязнения геномной ДНК и РНК, но концентрация ее очень мала. Тем не менее, ее вполне достаточно для химической трансформации E.coli. Если трансформировать 5µl выделенной плазмиды, то вырастает обычно около сотни колоний.
  • Плазмида также годится для проведения PCR.

    • По пунктам.

    п. 1.

  • Мы обычно растим дрожжи в SD среде с необходимым набором аминокислот. Если необходимо, с добавлением антибиотиков. В богатой среде YPD можно растить только те плазмиды, которые достаточно стабильны и не теряются в процессе роста дрожжей.

    • п. 4.

  • Литиказа (Sigma, #L4025) разрушает клеточную стенку дрожжей.

    • п. 13.

  • Мы используем стекловолоконные колонки фирмы Amersham (GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit, #27-9602-01). Можно также использовать кит фирмы Qiagen или любой аналогичный.

    • п. 14.

  • Пробирка берется такая, что бы уровень жидкости после центрифугирования в пунктах 15, 16,17 не касался нижнего края колонки. Можно использовать 2ml пробирки с завинчивающейся крышкой или пробирки из кита.

    • п. 15,16,17.

  • После каждого пункта, удалять жидкость, прошедшую через колонку.

    • п. 20.

  • Элюат - это то, что сошло с колонки.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100

Hosted by uCoz