Трансформация дрожжей кДНК библиотекой | Практическая молекулярная биология

Комментарии.

Общие.

Источник: "MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 2 User Manual", Clontech.
Компетентность этого метода примерно 10⁴колоний/µg плазмиды.
Двугибридный скрининг используют для поиска взаимодействующих белков. Для этого последовательность, кодирующая исследуемый белок, клонируется в BD вектор в такой рамке считывания, чтобы образовывался слитный белок с BD доменом. кДНК библиотека клонируется в AD вектор. После первичного скрининга вырастают колонии дрожжей, содержащие AD плазмиду, кодирующую белок, потенциально взаимодействующий с исследуемым белком.

По пунктам.

п. 2.

Дрожжи с чашки можно сохранить, суспендировав их в YPD среде с 20% глицерином. Хранить при -70^oC.

п. 3.

В плазмиду должна быть предварительно клонирована последовательность, кодирующая исследуемый белок.

п. 5.

Дрожжи, трансформированные BD плазмидой, можно сохранить, суспендировав их в SD среде с 20% глицерином. Хранить при -70^oC. Это удобно, не надо каждый раз делать трансформацию. Эти клетки можно использовать в дальнейшем для подтверждения взаимодействия тех клонов, которые будут получены после двугибридного скрининга.

п. 6.

Среда в эппендорфе должна стать заметно мутной.

п. 8.

Должны подрости до OD₆₀₀>1.5.

п. 10.

Должны подрости примерно до OD₆₀₀=0.5.

п. 11.

Мы осаждаем их в десяти 50ml нунках за два приемаx.

п. 25.

Рассев на чашки SD-leu-trp нужен для определения эффективности трансформации кДНК библиотеки. По количеству колоний на чашках можно расчитать, сколько бы выросло колоний, если бы мы рассеяли все дрожжи на среду SD-leu-trp. Это количество должно превышать количество независимых клонов в библиотеке. Например, мы трансформировали 500 µg библиотечной плазмиды при компетентности 10⁴колоний/µg и получили 5000, 500, 50 колоний на трех чашках. Значит мы провели скрининг 5x10⁶ колоний, что нормально при количестве независимых клонов в библиотеке 2x10⁶. Если эффективность трансформации получается выше, чем 10⁴колоний/µg, то можно трансформировать меньшее количество библиотеки. Эффективность трансформации имеет смысл определить в предварительном эксперименте, трансформировав аликвоту библиотеки и затем расчитать сколько надо взять в основной эксперимент.
Несколько разведений нужно для того, чтобы было удобно считать колонии. Компетентность заранее не известна, и можно при одном разведении получить слишком много или слишком мало колоний.

п. 26.

На среде SD-leu-trp-his вырастают колонии дрожжей, содержащие AD плазмиду, кодирующую белок, потенциально взаимодействующий с исследуемым белком.

> Методы > Двугибридная система > Трансформация дрожжей кДНК библиотекой. Трансформация дрожжей кДНК библиотекой.		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
Трансформация BD плазмидой. Приготовление компетентных клеток. Трансформация. Растворы. YPD среда SD среда TE/LiAc PEG/LiAc Геномная ДНК Комментарии. Общие. По пунктам.	Этот метод используется для трансформации дрожжей кДНК библиотекой, в дрожжевой двугибридной системе от Clontech. Для трансформации дрожжей индивидуальной плазмидой следует использовать этот протокол..
Трансформация BD плазмидой. Рассеять дрожжи со стока (-70^oC) на YPD чашку; Растить при 30^oC (примерно 1-2 дня); Трансформировать дрожжи BD плазмидой используя этот протокол; Высеять на чашку SD-trp; Растить при 30^oC (примерно 3 дня); Приготовление компетентных клеток. Суспендировать десяток колоний в 1ml SD-trp среды; В колбу с 150ml SD-trp среды посеять 1ml дрожжей из п.6; Растить 16-18h при 30^oC; В колбу с 1L YPD посеять ночную культуру до OD₆₀₀=0.2-0.3; Растить 3h при 30^oC; ЦФ в 50ml нунках 5', 4500rpm, RT; Суспендировать осадок в 500ml H₂O; ЦФ 5', 4500rpm, RT; Суспендировать осадок в 8ml свежеприготовленного раствора "TE/LiAc"; Трансформация кДНК библиотекой. Приготовить 100ml раствора "PEG/LiAc"; Cмешать: кДНК библиотека в векторе AD: 500µg геномная ДНК: 20mg; Добавить 8ml компетентных клеток, хорошо смешать; Добавить 60ml раствора "PEG/LiAc"; Бактериальная качалка, 30^oC, 30'; Добавить 7ml DMSO, мягко смешать; Heat shock 42^oC, 15', периодически смешивать, переворачивая пробирки; Охладить клетки во льду 2'; ЦФ 5', 4500rpm, RT; Суспендировать осадок в 10ml 1xTE; Высеять на три чашки SD-leu-trp аликвоты с десятикратным разведением: 1. 500µl 1xTE + 10µl дрожжей из п.24 (1/1000 от общего объема) 2. 500µl 1xTE + 50µl из пробирки 1 3. 500µl 1xTE + 50µl из пробирки 2; Высеять все дрожжи из п.24 на среду SD-leu-trp-his. Использовать 5-10 чашек размером 20x20см;