Проверка взаимодействия двух белков в двугибридной системе

Комментарии.

Общие.

Источник: "MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 2 User Manual", Clontech.
Плазмида pACT2 кодирует домен активации (AD) транскрипционного фактора GAL4, плазмида pAS2-1 - домен связывания (BD). В данной двугибридной системе используются дрожжи дефектные по синтезу лейцина, триптофана и гистидина и не способные расти на среде без этих аминокислот.
Плазмида pACT2 содержит ген LEU2, плазмида pAS2-1 ген TRP1. Дрожжи трансформированные pACT2 могут расти на среде SD-leu, трансформированные pAS2-1 - на среде SD-trp, обеими плазмидами - на среде SD-leu-trp. Колонии растут на среде SD-leu-trp-his, если содержат AD и BD плазмиды, кодирующие два взаимодействующих белка, так как в этом случае происходит активация репортерного гена HIS3.
В случае двух взаимодействующих белков должна происходить также активация второго репортерного гена - LacZ, что можно детектировать по синей окраске колоний при добавлении X-gal.

По пунктам.

п. 1.

Клонировать нужно в такой рамке считывания, чтобы образовывался слитный белок с AD доменом.

п. 2.

Клонировать нужно в такой рамке считывания, чтобы образовывался слитный белок с BD доменом.

п. 4.

На среде SD-leu-trp вырастают колонии, содержащие обе плазмиды, А и В. Этот рассев нужен для контроля трансформации. На среде SD-leu-trp-his вырастают колонии, если плазмиды A и В кодируют два взаимодействующих белка.

п. 5.

Если белки реально взаимодействуют, то колонии, выросшие на чашке SD-leu-trp-his, должны посинеть. Обычно, если колонии дрожжей хорошо растут на чашке SD-leu-trp-his (вырастают до размера более 2мм за 3-4 дня), то они и хорошо синеют ( за 0.5-1h).

п. 11.

На среде SD-leu-trp вырастают колонии, содержащие обе плазмиды. Этот рассев нужен для контроля трансформации.

> Методы > Двугибридная система > Проверка взаимодействия двух белков. Проверка взаимодействия двух белков в двугибридной системе.		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
Проверка взаимодействия. Контроли. Ожидаемый результат. Комментарии. Общие. По пунктам.	Достаточно быстрый и простой метод для проверки взаимодействия двух белков.
Проверка взаимодействия. В векторе pACT2 в правильной рамке проклонировать последовательность, кодирующую один из двух исследуемых белков ( плазмида A); В векторе pAS2-1 в правильной рамке проклонировать последовательность, кодирующую другой белок ( плазмида B); Трансформировать дрожжи одновременно плазмидой A и B, используя этот протокол; Рассеять трансформированные дрожжи на чашку со средой SD-leu-trp и SD-leu-trp-his; Если на чашке SD-leu-trp-his выросли колонии, проверить активацию гена LacZ, используя этот протокол; Контроли. Трансформировать дрожжи одновременно плазмидой A и pAS2-1, используя этот протокол; Рассеять на среду SD-leu-trp и SD-leu-trp-his; Трансформировать дрожжи одновременно плазмидой B и pACT2, используя этот протокол; Рассеять трансформированные дрожжи на среду SD-leu-trp и SD-leu-trp-his; Если на чашках SD-leu-trp-his в п.7,9 выросли колонии, проверить активацию гена LacZ, используя этот протокол; Ожидаемый результат. На чашках SD-leu-trp в п.4,7,9 должны вырасти по несколько сотен колоний; В случае реального взаимодействия двух исследуемых белков, дорожжи должны расти на чашке SD-leu-trp-his в п.4 и синеть в п.5. На контрольных чашках SD-leu-trp-his в п.7,9 не должны расти, а при незначительном росте не должны синеть.