Хранение бактериальных штаммов | Практическая молекулярная биология

Комментарии.

Общие.

Новый "фирменный" штамм используется (без размораживания) только для создания -70^oС стока: высеять штрихом, поставить 5 ночных культур (3 - из различных индивидуальных колоний, 2 - из массы колоний), далее начиная с "п.2.".
Хранение в столбиках имеет смысл использовать только для транспортировки клеток при комнатной температуре.
Весьма распространенно беспокойство по поводу качества DMSO, длительное время хранившегося при NT. Мы убеждены, что, если речь идет о хранении замороженных бактериальных клеток, то беспокоится не о чем.

По пунктам.

п. 2.

Глицерин и DMSO предотвращают образование больших кристаллов воды, которые разрушают бактериальные клетки.
Нам больше нравится метод, использующий DMSO, т.к.

(i) его (DMSO) нет нужды стерилизовать,
(ii) глицерин вязкий, фасовать приходится на весах.

Очень хорошая альтернатива в случае большого количества пробирок - добавлять к 500µl культуры 500µl среды с 30% глицерином.
Можно разаликвотить глицерин (или DMSO) заранее и хранить при NT (+4^oС), соответственно.

п. 5.

Нам больше нравится, когда петля платиновая.
Мы стерилизуем петлю следующим образом:

стерилизация:

раскалить петлю до красна на пламени горелки;

охлаждение:

погрузить проволочку (но не её держатель) в спирт;
быстро провести над горелкой (что бы спирт загорелся);
охладить на воздухе ~2'. Если охлаждалось меньшее время, можно перед тем, как забрать колонию прижать петлю на 3-5'' к свободному от бактерий участку агара на чашке (смысл процедуры в том, что на воздухе раскаленная до красна петля остывает довольно долго. В спирте - быстрее. Конечно, при сгорании спирта она нагревается вновь, но уже не так сильно).

пп. 9, 10

Удобнее стерилизовать две петли, и работать одной пока вторая остывает после стерилизации.
Штриховка - чтобы разбавить плотную смесь до отдельных клеток.

> Методы > Работа с бактериями > Долговременное хранение. Хранение бактериальных штаммов.		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
На -70^oС (неограниченное время). Приготовление стока. Высев клеток из -70^oС стока. В анаэробных условиях в столбиках (до года). Приготовление стока. Высев клеток из столбика. Комментарии. Общие. По пунктам.	На наш взгляд, долговременное хранение оправдано для (i) коллекционных культур и для (ii) штаммов-продуцентов. Для последних, кроме коллекционных пробирок имеет смысл готовить серьёзные аликвоты для выращивания (часто эти штаммы нестабильны и приготовить сток аликвот значительно проще, чем каждый раз контролировать эффективность экспрессии).
На -70^oС (неограниченное время). Приготовление стока. вырастить ночную культуру (можно с антибиотиком); 5-15% глицерин: перенести 850µl культуры в пробирку с 75-150µl глицерина; 7% DMSO: перенести 930µl культуры в пробирку с 70µl DMSO; смешать, заморозить в жидком азоте; хранить на -70^oС неограниченное время. Высев клеток из -70^oС стока. NB!!!Во время высева пробирка с клетками должна постоянно находиться в жидком азоте. раскалить петлю на пламени горелки; воткнуть в культуру, дать ей вмёрзнуть; выдернуть петлю из пробирки вместе с несколькими микролитрами намёрзшей культуры; перенести на чашку, размазать в небольшое пятнышко; простерилизовать петлю, сделать серию параллельных штрихов; сделать ещё несколько серий параллельных штрихов (см. Рис.), стерилизуя петлю между сериями. В анаэробных условиях в столбиках (до года). Приготовление стока. разлить по ~1.2ml агара (без антибиотиков) в 2ml пробирки с завинчивающимися крышками; снять петлёй бактериальную колонию (или обмакнуть петлю в ночную культуру); 2-3 раза воткнуть петлю в столбик; плотно завинтить крышку, хранить в темноте при NT. Высев клеток из столбика. воткнуть стерильную петлю непосредственно в культуру столбика; перенести на чашку, размазать в небольшое пятнышко; простерилизовать петлю, сделать серию параллельных штрихов; сделать ещё несколько серий параллельных штрихов (см. Рис.), стерилизуя петлю между сериями.