Комментарии.
Общие.
- Источник: Lee SY, Rasheed S. A simple procedure for maximum yield of high-quality plasmid DNA. Biotechniques. 1990 Dec; 9(6):676-9.
- в случае большого количества плазмид работу можно значительно ускорить, подготовив заранее 3 набора подписанных пробирок:
1.7-2.0ml пустые (для п. 2),
1.7ml с 0.5ml изопропанола (для п. 12),
0.5ml с 0.1ml изопропанола (для п.18).
- Ограничение: метод "не любит" плазмиды со строгим контролем (низкокопийные). Сильно снижается выход и качество. В этом случае начиная с п.11 лучше пользоваться фенольной очисткой. Низкокопийные плазмиды в настоящее время чаще всего встречаются в двух "экологических нишах": старые генно-инженерные конструкции в векторе pBR322 и вектора (конструкции) для экспрессии белков.
- "II плазмидный раствор" Во многих протоколах подчеркивается, что этот реактив должен быть свежеприготовленным. Это не обязательно. Важно только, что бы в процессе хранения CO2 из воздуха не нейтрализовал NaOH => посудина должна быть с плотно завинчивающейся крышкой, и лучше пластиковой (стекло растворяется в щелочи).
По пунктам.
п. 1.
- Дополнение: для выкалывания бактериальных колоний и старта минипрепов можно выкалывать колонии 200µl типами и отстреливать их сразу в пробирки со средой - экономит время и стерильно (меньше возни, чем с зубочистками).
Александр Чубыкин.
п. 6.
- Это время необходимо для работы лизоцима. Если лизоцим не добавлен, можно сразу переходить к п.7.
п. 7.
- Лизис бактерий и щелочная денатурация DNA. Нужно постараться как можно меньше раздробить геномную DNA на этом этапе, иначе возникнут проблемы с ее осаждением в п.11.
- Требования, предъявляемые в п.7, противоречивы. Для того, чтобы получить полный лизис, требуется хорошо смешать бактериальную суспензию с раствором "II", однако, интенсивное смешивание грозит дроблением геномной DNA. Мы поступаем следующим образом:
7.1. непосредственно перед внесением (<1') раствора "II" вновь взболтать суспензию бактерий: вортекс - 2-4'';
7.2. не касаясь пробирки типом быстро внести 400µl раствора "II"; сразу же закрыть пробирку; резко встряхнуть 2-3 раза. Для того, чтобы прошел лизис требуется ~2''. надо уложиться со встряхиванием в это время;
7.3. через ~1' медленно перевернуть пробирку 2-3 раза.
п. 8.
- Превышение времени денатурации чревато тем, что плазмида денатурирует необратимо - одно кольцо сдвинется относительно другого так далеко, что достигнет локально устойчивого состояния. Необратимо денатурированные плазмиды вполне годятся для сиквенса, но не режутся рестриктазами и обладают аномальной подвижностью на электрофорезе.
п. 9.
- Нейтрализация раствора.
- Геномная DNA случайно регибридизуется образуя большие сети, кольцевая pDNA благополучно ренатурирует. Белки с SDS агрегируют при высокой концентрации соли (на холоду это получается лучше).
- Важно, чтобы нейтрализация была полной и не осталось областей с вязким раствором. Нужно смешивать раствор вначале мягко, чтобы не дробить геномную DNA, но после того как она уже ассоциирует (через ~1'), ничто не мешает встряхнуть посильнее. Однако, всё же не на вортексе.
п. 10.
- Можно прерваться (+4oC, несколько суток).
п. 12.
- В этой методике можно прерваться при любом осаждении нуклеиновых кислот после добавления спирта (-20oC, любое время).
п. 15.
- В этом месте важно работать быстро и аккуратно, так как pDNA будет плохо растворяться если оставить много изопропанола или пересушить осадок.
п. 16.
- Устранение большей части рибосомной RNA. В высокой соли одноцепочечная RNA образует большие ассоциаты (может быть за счет случайной гибридизации) и не растворяется. Однако tRNA (видимо, из-за легкости образования внутримолекулярных двухцепочечных участков) сравнительно легко растворяется в высокой соли. Если требуется устранить и её, нужно выполнить п.п. 21a-e.
- В этом месте важно работать быстро и аккуратно, так как pDNA будет плохо растворяться если оставить много изопропанола или пересушить осадок.
п. 21.
- Отмывка от изопропанола.
п. 21a-e.
- Расщепление tRNA и остатков рибосомной RNA.
- Важно, иметь в виду, что рибонуклеотидтрифосфаты, образующиеся после расщепления RNase вполне способны выпасть в осадок вместе с плазмидной DNA и выдержать споласкивание 70% EtOH. => измерять концентрацию pDNA с помощью спектрофотометра дело опасное даже после обработки RNase.
|
