Экспресс-метод выделения pDNA | Практическая молекулярная биология

Комментарии.

Общие.

На форезе видны геномная DNA, pDNA, рибосомная RNA и tRNA. Если размер pDNA < 3.5-4kbp она идёт слишком близко к рибосомной RNA и для аккуратного определения размера требуется включить в п.4 обработку RNase .
Легкое неудобство, связанное с методом : раствор в п.8 весьма вязкий и имеет склонность выскальзывать из лунки на поверхность форезного буфера при неаккуратном нанесении (важно, чтобы над гелем было ~2-3mm буфера, иначе, как ни наноси - всё равно выскользнет).
Если плазмида со строгим контролем (низкокопийная) нужно быть готовым к тому, что видно ее будет очень плохо.

По пунктам.

п. 1

Дополнение: для выкалывания бактериальных колоний и старта минипрепов можно выкалывать колонии 200µl типами и отстреливать их сразу в пробирки со средой - экономит время и стерильно (меньше возни, чем с зубочистками).
Александр Чубыкин.
Бактерии можно выращивать в 2ml или 1.7ml эппендорфах.

п. 4

4а. ресуспензировать осадок в 40µl TE+RNase(50µg/ml), вортекс 5'';
4b. NT, 5-10';

п.5.

Лизис бактерий, белки уходят в органическую фазу, в водной остаются нуклеиновые кислоты.

> Методы > Плазмиды > Экспресс-метод. Экспресс-метод выделения pDNA.		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
Комментарии. Общие. По пунктам.	Очень удобный и быстрый метод, когда требуется быстро проанализировать наличие вставки в векторе, размер плазмиды и т.п.
растить ночную культуру 16-24 часа в богатой среде: 37^oС, 200-300rpm; 0.2ml ночной культуры поместить в 1.7ml пробирку; ЦФ 30'', удалить супер; ресуспензировать осадок в 40µl 1х TE (или TAE), вортекс 5''; добавить: 40µl Ф:Х, 4µl 10х SDS⁽⁺⁾-буфера для внесения; вортекс 20''; ЦФ 5'; 15-20µl водной фазы на форез.