Перенос по Southern (в буфере с высокой ионной силой) | Практическая молекулярная биология

Комментарии.

Общие.

SSC - не единственный возможный буфер для переноса. Было показано, что даже более хорошие результаты дает использование:

* NH₄Ac 1M, NaP (pH 6.5) 25mM
* или NH₄Cl 1M, NaP (pH 6.5) 25mM

Есть сообщение, что присутствие Mg²⁺ ингибирует связывание DNA с мембраной при dot-blottinge (даже при ~ 1mM). Добавление EDTA до 100 mM перед денатурацией восстанавливает связывающую способность даже для 6mM MgCl₂.

По пунктам.

п. 4.

Апуринизация приводит к умеренному дроблению DNA (фрагменты большого размера (>5kbp) плохо проходят сквозь агарозу при переносе). Важно не превышать указанное время.

п. 9.

Очень удобно, когда подложка имеет размер геля. В этом случае нет нужды прокладывать парафильм в п. 10.

п. 10.

Чтобы положить гель без пузырей надо налить на подложку немного буфера для переноса.

п. 12.

Мембраны плохо (долго) смачиваются в растворах с высокой ионной силой. Если хочется сделать это побыстрее, то лучше смочить мембрану в mQ, а затем ополоснуть в 20xSSC.

п. 19.

Практически во всех руководствах пишется, что зафиксировать DNA на нитроцеллюлозной мембране можно лишь запеканием в вакууме 80^oС, ~2h (кстати, для этого удобно использовать гель-драер; нейлоновые мембраны тоже можно фиксировать "запеканием", но для них вакуум не обязателен). Тем не менее мы беспроблемно фиксировали DNA на нитроцеллюлозе ультрафиолетом.
Можно запечь мембрану в микроволновой печи ~2.5 min при W~750-900W (нет переэкспозиции, если и в 2 раза дольше).

> Методы > Электрофорез > Саузерн (перенос в SSC). Перенос по Southern (в буфере с высокой ионной силой).		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
Растворы. HCl 0.25M Денатурирующий буфер Нейтрализующий буфер Комментарии. Общие. По пунктам.	Буфер с высокой ионной силой применяется для нитроцеллюлозных и нейтральных или отрицательно заряженных нейлоновых мембран. Для переноса на положительно заряженные нейлоновые мембраны (такие как HybondN⁺) можно использовать щелочной перенос, при котором фиксация DNA на мембране происходит одновременно с переносом (Перенос по Southern (щелочной).).
зарисовать маркер; отрезать 1/2 маркера, лишний гель, лунки, правый верхний угол геля; измерить и записать размер геля; качать в 0.25M HCl (+ 10' после того, как пожелтеет бромфеноловый синий); сполоснуть H₂O; мягко качать в денатурирующем буфере (+ 15' после того, как бромфеноловый синий поменяет цвет) ~20'; мягко качать в нейтрализующем буфере (+ 15' после того, как бромфеноловый синий поменяет цвет) ~20'; в это время подготовить: * 3 куска ватмана 3MM по размеру геля; * 2 больших куска ватмана 3MM - на подложку; * мембрану Hybond N⁺ (размер геля +3-5mm c каждой стороны); * 4 ленты парафильма; * стопку фильтровалки; поочередно обмакнуть в 20x SSC большие куски ватмана и положить их на подложку без пузырей, опустить концы в 20x SSC; положить гель дном вверх (без пузырей), налить сверху немного 20x SSC; подложить рядом ленты парафильма так, чтобы мембрана не соприкоснулась с 3MM когда гель сожмется; мембрану смочить в 20x SSC, положить на гель (без пузырей); сверху - 3 куска ватмана 3MM (нижний перед укладкой смочить в 20x SSC), стопку фильтровалки, плоскую пластину и грузик (~300g для 10x10cm²геля); перенос в 20x SSC 2-16h; зарисовать на мембране карандашом границы геля; подписать мембрану; прополоскать ~5' в 2хSSC; срезать ненужные участки; фиксировать DNA ультрафиолетом UV=120^mJ/cm² завернуть в Saran Wrap, хранить при NT или при -20^oС.