Выделение ДНК из агарозного геля с помощью glass milk | Практическая молекулярная биология

Комментарии.

Общие.

Очистка на glass milk, как и на любых других silica-particles приводит к частичной денатурации DNA. Это особенно опасно в случае гетерогенной DNA. Если предполагается использование очищенного материала в процедурах, требующих, чтобы DNA была двухцепочечной (например, расщепление рестриктазами), то лучше glass milk не использовать.
Метод позволяет выделять фрагменты ~0.2-15kbp с эффективностью не менее 80%. Его можно использовать и для очистки DNA в водных растворах (между ферментативными реакциями, после PCR и т.п.) В этом случае процедура начинается с п.3.
Для фореза нужно использовать TAE буфер.
Принцип метода: DNA связывается с silica-particles в высокой соли. Примеси отмываются. DNA снимается Tris-буфером или водой.
Адсорбция зависит от pH, резко уменьшаясь при pH>7.5. Для визуального контроля в NaI вводится Cresol red: при pH<7.5 он желтый, а при pH>7.5 - красный.
Эффективность элюции зависит от элюирующего буфера: концентрации соли должна быть минимальной, а pH должен быть >8.0.

По пунктам.

п. 1.

Коротковолновое UV- облучение (254nm) может очень сильно понизить эффективность трансформации (365nm облучение сказывается слабо). "Вредоносность" 254nm облучения зависит от размера pDNA. 1' облучения уменьшает эффективность клонирования pDNA в:

3.2kb	~ 4 раза
4.8kb	~ 30 раз
8.2kb	~ 500 раз

Можно увидеть DNA и при обычном свете, если использовать для окраски Cristal Violet (стоковый раствор 2mg/ml). В агарозный гель добавить до 0.80-1.6µg/ml (40-80µl на 100 ml); уходит из геля к отрицательному полюсу. Образец наносить, добавив 6х Load. Buffer:

Glycerol => 30%
EDTA => 20mM
Cristal Violet => 100µg/ml.

п. 2.

Взвесить - все равно, что измерить объем, только технически проще.
Вырезанную полоску агарозы можно хранить несколько дней при -20^oС

п. 3.

Объём NaI должен быть таким, чтобы:

агароза составляла<0.25% от финального объема,
но не менее 3хV_геля.(или объёмов ферментативной реакции).

например: для 0.75% геля - 3xV_геля; 1.0% - 3xV_геля; 1.5% - 5xV_геля.

п. 4.

Желтый цвет NaI позволяет лучше видеть не расплавившуюся агарозу. Агароза плавится за ~5' .

п. 5.

Адсорбция DNA на частицы SiO₂ зависит от pH, резко уменьшаясь при pH>7.5. Желтый цвет "NaI" соответствует pH<7.5.

п. 6.

Изопропанол улучшает адсорбцию DNA. Это особенно важно при выделении небольших (<0.7 kbp) фрагментов.
Для малых (<500bp) фрагментов лучше дополнительно добавить 1/20V 1% уксусной кислоты. Это приводит к понижению рН до ~ 6.5.
Повышение температуры до 55^oС улучшает связывание.

п. 7.

Ёмкость SiO₂: >2µg 3kbp линейной dsDNA на 1µl 50% суспензии, но если использовать <1µl/µg, частицы SiO₂ начинают агрегировать.
С объемами 50% суспензии SiO₂ меньшими, чем 0.5µl, работать неудобно, видимо, разумный компромисс - 2-3µl, если количество DNA меньше, чем 1µg. Если больше, то дополнительно по 2µl на каждый дополнительный микрограмм DNA.
Еще одно соображение, чтобы в растворе была приемлемая концентрация silica particles: для 0.5ml - минимум 8µl, для 1.0ml - минимум 16µl.

п. 9-13.

Отмывка. Смываются: праймеры, соли, белки, агароза, EtBr, масло, DMSO, детергенты.

п. 11.

В STE/EtOH SiO₂ частицы ресуспензируются с трудом, вполне вероятно, что вместо Vortex придется применять пипетирование.

п. 13.

Если это необходимо, можно убрать остатки EtOH, подсушив glass milk (5-10' на столе или 2-5' под вакуумом).

п. 14-18.

Элюция DNA. DNA можно снимать с частиц в любом низкосолевом буфере, но важно, чтобы pH был в районе 7.0-8.5.
Прогрев особенно важен, если DNA длинная (>5kbp).
Если стараться забрать всю водную фазу, неизбежно захватывается некоторое количество glass milk. Для большинства применений это не опасно, т.к. SiO₂-частицы слабо связывают DNA в растворах с менее, чем 3М солью. Если все же желательно избавиться от SiO₂:

* перед использованием ЦФ полученный раствор, а аликвоту отбирать с самого верха;
* ЦФ через ЦФ-фильтр.

Остаточное загрязнение NaI можно проконтролировать по UV поглощению. NaI имеет 2 максимума: один в районе 195nm, второй- 226.5nm => C_NaI[µM] =74xA_226.

п. 20.

Вторая элюция может дать дополнительно 10-20% DNA.

п. 21.

SiO₂- Sigma, #S-5631

п. 22.

Отмывка кислотой частиц SiO₂от грязи.

п. 23-25.

Отмывка от кислоты.
Отмывка от слишком мелких частиц SiO₂.

п. 26.

Отмывка от слишком крупных частиц SiO₂.

> Методы > Выделение ДНК из агарозного геля > С помощью "glass milk". Выделение ДНК из агарозного геля с помощью "glass milk".		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
Очистка DNA из агарозного геля. Приготовление glass milk. Растворы. STE/EtOH NaI EB Комментарии. Общие. По пунктам.	Метод можно использовать для выделения/очистки как двухцепочечной, так и одноцепочечной DNA.
Очистка DNA из агарозного геля. вырезать нужную полоску под длинноволновым UV (360 nm); взвесить; + необходимый объём "NaI"; 50^oС, 10' или пока вся агароза не расплавится (время от времени помешивая); проверить, что цвет раствора желтый (если красный - добавить немного (1-5µl) 3M NaOAc, pH~5); + объём изопропанола, равный объёму геля; + необходимое количество 50% SiO₂ мягко смешивать ~5' NT; ЦФ 5'', сбросить супернатант; не обязательно если требования к чистоте фрагмента очень высокие - сполоснуть 100-200µl "NaI"; добавить 0.5ml STE/EtOH, либо пипетировать, либо вортекс, ЦФ 5'', сбросить супернатант; повторить п.11 ещё 2 раза; ЦФ 5'', тщательно убрать остатки STE/EtOH; не обязательно если DNA чистится для электропорации, дополнительно промыть 1 раз 80% EtOH. + EB в объеме, не меньшем, чем объем glass milk; вортекс 5-20''; 20^о-50^oС, 1-5'; ЦФ 20''; перенести супернатант в новую пробирку; можно элюировать остатки DNA с glass milk ещё раз. Приготовление glass milk. в 200ml стакане суспензировать с помощью магнитной мешалки 10g Silicon dioxide в ~100ml кислоты (азотной или соляной), 2h-ON; 2x промыть ~100ml смеси (метанол:соляная кислота=1:1); в 200ml стакане суспензировать с помощью магнитной мешалки в ~150ml H₂O; дать осесть под действием силы тяжести (~15'), сбросить надосадочную жидкость; повторить (п. 23, 24) 4 раза; дать осесть под действием силы тяжести 2', забрать надосадочную жидкость; осадить в 50ml пробирке (ЦФ 5krpm, 3'); добавить объём H₂O равный объёму SiO₂, суспензировать. хранить рабочий сток (~1ml) при NT, основной - при -20^oС.