Комментарии.
Общие.
- Суть метода: DNA (RNA) агрегирует в 70% EtOH в присутствии соли (агрегация проходит лучше на пониженной температуре и для неё требуется некоторое время). Затем образовавшиеся агрегаты осаждаются центрифугированием.
- На всякий случай напомним, что DNA (RNA) в растворе это не кислота, а соль и катион у неё тот же, что и у соли, использованной для осаждения.
 Было показано, что понижение температуры и увеличение времени инкубации от {0oС, 15'} в (п. 4) не оказывает заметного влияния на эффективность осаждения (для >20ng/ml). Наиболее заметный эффект даёт увеличение времени центрифугирования {до ~1h при 4oС}.- Осаждение улучшается, если добавить MgCl2 до 10mM.
- Копреципитация:
фосфаты >1mM,
EDTA >10mM.
- Этанол (96% и 70%) и изопропанол нужно хранить в плотно (!!!) закрывающихся ёмкостях. Дело в том, что только 40% водка на открытом воздухе не меняет концентрацию спирта. Все, что имеет больший процент - обводняется. Рабочие аликвоты удобно хранить при -20oС. Сразу два преимущества: (i) раствор с DNA быстрее становится холодным; (ii) в морозильнике меньше проблем с обводнением.
По пунктам.
п. 1.
Тип и концентрация моновалентных катионов.
- NH4Ac - сток: 10.0M; рабочая концентрация: 1.6-2.5M. Часто используют, чтобы уменьшить копреципитацию dNTPs (2-кратное переосаждение приводит к удалению ~99% dNTP’s). Слабо осаждает полисахариды.
Ограничение: ионы NH4+- ингибиторы полинуклеотидкиназы.
- LiCl - сток: 8.0M; рабочая концентрация: 0.8M. Хорошо растворим в спиртовых растворах и используется, когда требуются высокие концентрации EtOH. LiCl (без EtOH) селективно осаждает длинную RNA.
Ограничение:ионы Li+- ингибиторы cell-free трансляции и обратной транскрипции.
- NaCl - сток: 5M; рабочая концентрация: 0.2M. Применяется для осаждения DNA из растворов, содержащих SDS (другие соли высаживают SDS существенно лучше).
- NaAc - сток: 3.0 (pH5.2), рабочая концентрация: 0.3M. Обычная преципитация DNA.
п. 2.
Соосадители.
- Соосадители применяются для преципитации малых количеств DNA (RNA) и приводят к сразу двум полезным эффектам:
* улучшается эффективность осаждения,
* осадок становится заметным, уменьшается вероятность его случайной потери.
- Перечисленные ниже соосадители благополучно выдерживают экстракцию органическими растворителями (т.е. остаются в водной фазе при такой экстракции).
- Самый главный критерий при выборе соосадителя - нужно, чтобы он не мешал последующему применению DNA (RNA). Например, tRNA может ингибировать связывание с белками, мешает дефосфорилированию и спектрофотометрическому определению концентрации.
(1)
tRNA - cток: 10µg/µl, (хранить при -20oС), рабочая концентрация - 5-10µg/ml (но не менее 5µg на осаждение);
(2)
линейный РАА - cток: 2.5µg/µl, (хранить -20-4oС), рабочая концентрация - 10-20µl/ml (но не менее 10µg на осаждение). Линейный PAA хорошо осаждает от 20bp, практически не осаждает <10bp. Можно использовать для селективный преципитации меченных олигонуклеотидов. Не поглощаетUVв диапазоне 260-280nm.
Приготовление линейного РАА.
- приготовить смесь:
(3)
гликоген: рабочая концентрация 50µg/ml. Удобно использовать 20х раствор:
EDTA 0.2M
гликоген 1µg/µl,
(хранить при -20oС). Если применяется гликоген, не инкубировать при пониженной температуре в п.4 (!!!), иначе в осадок выпадет и нежелательные компоненты. Хорошо смешать и сразу центрифугировать NT, 20'. Не поглощает UV в диапазоне 260-280nm.
Приготовление гликогена.
Коммерческий гликоген молекулярно биологического качества весьма дорог, правда расходуется он очень медленно и, вероятно, вам удастся его у кого нибудь "стрельнуть". Если нет, можно приготовить самому.
- растворить 5g гликогена (from Oyster, Sigma G8751) в 10ml H2O;
- Ф; Х;
- осадить, добавив 1V EtOH;
- ЦФ, подсушить;
- взвесить осадок и растворить в H2O в концентрации 20mg/ml;
- хранить при –20oС в 1ml аликвотах.
п.3.
Вместо этанола можно использовать изопропанол. В этом случае добавляется не 2.5V а 1V. Изопропанольное осаждение имеет только одно преимущество перед этанольным - пробирки могут быть меньшего объема. Основной недостаток - изопропанол менее летуч и промывка 70% EtOH обязательна.
п. 4.
Температура преципитации.
* если концентрация >20ng/ml => 0oС, 15-30'.
* для низкой концентрации или маленьких размеров (~100bp) => + MgCl2до 10mM, -20oС, 1h.
п. 5.
Время и скорость центрифугирования.
* если концентрация >20ng/ml => 10kg, 10-15', 4oC;
* меньшие концентрации, малые фрагменты: 1-2h, 4oC, 27krpm.
Осадок DNA часто не виден. При осаждении в угловом роторе стоит отметить сторону, на которой потом нужно будет искать осадок (или ориентировать подписанные пробирки надписью от центра). Когда мы используем 0.2-2.0ml пластиковые пробирки, мы ВСЕГДА (это уже привычка) ориентируем их в центрифуге "хвостиками" наружу.
п.6.
Промывка 70% EtOH удаляет избыток соли и остатки исходного буфера.В случае массивных осадков недостаточно просто налить и убрать 70% EtOH. Необходимо встряхивать ~1'.
п. 7.
DNA, особенно длинная (например, геномная, даже расщепленная рестриктазой), очень плохо растворяется, если ее пересушить (особенно не рекомендуем высушивать DNA под вакуумом, кроме всех прочих проблем при этом DNA короче ~400bp ещё и денатурирует). Мы поступаем следующим образом: после осаждения (или промывки 70% EtOH) сбрасывается супернатант. На стенках пробирки неизбежно остаются капли. Если ждать, пока они высохнут, осадок наверняка пересохнет. Поэтому мы проводим краткое (30'') центрифугирование и вытянутым типчиком удаляем жидкость рядом с осадком. Сразу после этого DNA можно растворять.
Если все же случилось так, что DNA пересушена и осадок растворяется плохо, может помочь или прогрев до ~70oС, или замораживание на -20oС, а затем оттаивание. Но все это - силовые меры, до которых лучше дело не доводить.
Особенно серьёзными проблемы с растворимостью могут быть, если используется буфер с высокой ионной силой. Поэтому, если требуется получить раствор DNA(RNA) в буфере с высокой ионной силой, лучше вначале растворить нуклеиновую кислоту в буфере с низкой ионной силой и лишь затем поднять концентрацию соли.
|
