Лигирование | Практическая молекулярная биология

Дефосфорилирование можно проводить прямо после рестрикции (не переосаждая). CIP работает в следующих буферах компании New England Biolabs: NEBuffer 2, 3, 4 (и для EcoR I, BamH I, Sal I).

а) (optional) инактивировать теплом рестриктазу;
б) + CIP*, 30'-1h 37^oC;
в) очистка на форезе.

* 0.1u/pmol 5' концов (~1µg 3kb фрагмента); для 3' и тупых концов брать в 10 раз больше. Разводить CIP в 1х буфере перед применением. Если буфер не подходит его можно быстро заменить на спин-колонке (лучше после инактивации рестриктазы).

При лигировании существует оптимум концентраций вставки и вектора (использование слишком низких концентраций вызовет преимущественное самолигирование, слишком высоких - преимущественное образование конкатамеров).

1µg/ml< C_oпт(Vector + Insert) <7µg/ml,

Сильное ингибирование, если C>10µg/ml.

Оптимально, если вектор дефосфорилирован, а Insert/Vector <1.
При лигировании лучше не использовать t^o=+4^oC. Лучше лигировать:

* тупые концы: 14^oС ON,
* липкие: 14-16^oС ON (для библиотек); NT (на столе) 1-2h для рутинного лигирования.

Введение в лигазную смесь 5% PEG приводит к повышению скорости лигирования в 3-6 раз.
ATP можно добавить непосредственно к лигазе до 5-10mM.

> Методы > Клонирование > Лигирование. Лигирование.		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.

Дефосфорилирование можно проводить прямо после рестрикции (не переосаждая). CIP работает в следующих буферах компании New England Biolabs: NEBuffer 2, 3, 4 (и для EcoR I, BamH I, Sal I). а) (optional) инактивировать теплом рестриктазу; б) + CIP, 30'-1h 37^oC; в) очистка на форезе. 0.1u/pmol 5' концов (~1µg 3kb фрагмента); для 3' и тупых концов брать в 10 раз больше. Разводить CIP в 1х буфере перед применением. Если буфер не подходит его можно быстро заменить на спин-колонке (лучше после инактивации рестриктазы). При лигировании существует оптимум концентраций вставки и вектора (использование слишком низких концентраций вызовет преимущественное самолигирование, слишком высоких - преимущественное образование конкатамеров). 1µg/ml< C_oпт(Vector + Insert) <7µg/ml, Сильное ингибирование, если C>10µg/ml. Оптимально, если вектор дефосфорилирован, а Insert/Vector <1. При лигировании лучше не использовать t^o=+4^oC. Лучше лигировать: * тупые концы: 14^oС ON, * липкие: 14-16^oС ON (для библиотек); NT (на столе) 1-2h для рутинного лигирования. Введение в лигазную смесь 5% PEG приводит к повышению скорости лигирования в 3-6 раз. ATP можно добавить непосредственно к лигазе до 5-10mM.