Комментарии.
Общие.
- Суть реакции Random primer: DNA, которая служит матрицей денатурируется, и с ней гибридизуются случайным образом 6-нуклеотидные затравки. DNA-полимераза удлиняет их, используя радиоактивно меченые нуклеотиды.
- концентрация праймера не оказывает существенного влияния на размер образующихся продуктов.
- для эффективного синтеза различные матрицы требуют существенно различных концентраций праймера. концентрация, которая используется в методике избыточна для большинства матриц. Избыточность праймера используется для того, чтобы обеспечить более или менее равное мечение различных участков матрицы.
- Стоит обратить внимание на то, что удельная активность вновь синтезируемой DNA определяется только удельной активностью используемого радиоактивного трифосфата. Количество добавленной в реакцию матрицы роли не играет. Количество добавленной матрицы проявляется в другом:
- хватит ли матрицы на то, чтобы израсходовать радиоактивно меченные дезоксинуклеотидтрифосфаты;
- в конкуренции с меченной DNA в последующей гибридизации.
Чтобы получить высокое удельное включение применяются два различных подхода:
- Разумный компромисс: в реакцию берётся лишь столько матрицы, сколько требуется для того, чтобы израсходовать радиоактивные трифосфаты. Допустим, взято 10µCi a[32P]dCTP с удельной активностью 3kCi/mmol, следовательно, максимально возможное количество DNA, которое можно при этом синтезировать:
(10µCi х 4х300g/mol) / 3kCi/mmol = 4ng
Видимо, резонно превысить это количество не более, чем раза в два.
- Принципиальное решение проблемы: по окончании реакции матрица отделяется от синтезированной DNA. Для этого перед реакцией матрица либо иммобилизуется на твердом носителе, либо метится фотобиотином.
- Справочные данные по изотопам можно найти в "Радиоизотопы и флуорофоры".
- Оценка количества метки с помощью ручного счетчика.
Если детектор счетчика практически полностью накрывает Ваш образец, то можно считать, что он захватывает ~40% вылетевших частиц. Допустим, что счетчик показывает 1000Bq (counts per second), тогда под детектором:
1000[Bq]/3.7x104[Bq/ µCi]/0.4 ~ 0.07 µCi
По пунктам.
п. 2.
- Денатурация матрицы, отжиг 6-членных олигонуклеотидных затравок.
п.8.
- В состав "STOP" входит SDS (чтобы остановить реакцию), Salmon sperm DNA (чтобы предотвратить DNA-специфическую сорбцию на spin - колонке.
п.10.
- Вначале просчитать колонку вместе с элюатом, а затем убрать колонку и просчитать только элюат. Это очень быстрый, но не слишком точный (скорее качественный) метод.
|
