Форез олигонуклеотидов | Практическая молекулярная биология

Комментарии.

Общие.

Мы не можем поручится, что описанные ниже проблемы не были связаны с качеством геля, но когда мы пытались разогнать на индивидуальной дорожке (3x0.6mm²) ~40fmol меченных олигонуклеотидов, мы получили фон > сигнала. Если брать большее количество олигонуклеотидов, фон остается приблизительно тем же, а сигнал увеличивается. Видимо проблему так же можно решить добавлением "носителя": tRNA или totalRNA.

По пунктам.

п.3.

Силиконизирование - см. "Сиквенс". Пластину из окиси титана тоже можно силиконизировать.

п.6.

Вполне можно пользоваться и промежуточными концентрациями.

п.8.

Кислород - ингибитор полимеризации. Без дегазации гель, конечно, заполимеризуется, но за большее время (в этом случае стоит увеличить в ~1.5 раза количество PSA и TEMED).

п. 9.

Если вставить гребенку после заливки геля, можно сдвинуть прибор и повредить агарозную пробку.

п.12.

Удобно отлить из остатков гелевого раствора ~0.5 -1.0ml в 1.7ml пробирку и использовать ее как индикатор полимеризации.

п.13.

Если проводить форез при повышенной температуре, будет меньше проблем со вторичной структурой олигонуклеотидов.
п.15.
Лучше (но обычно не обязательно), если олигонуклеотиды наносятся на форез прямо с 55^oС.
Выбор красителя в 2х буфере. Любой из красителей облегчает нанесение на форез.

Бромфеноловый синий и ксиленцианол - (стоковые растворы 1% в H₂O; рабочая концентрация в 1х буфере ~0.01-0.05%) позволяют иметь представление о том, где в геле находятся олигонуклеотиды определенной длины. Но они могут создавать проблемы при наблюдении олигонуклеотидов.
OrangeG - (стоковый раствор 1% в формамиде; рабочая концентрация в 1х буфере ~0.01-0.05%) идет очень низко, для препаративных форезов лучше использовать именно его (а БФ и КЦ наносить где нибудь у края на пустую дорожку).

Подвижность красителей в денатурирующемPAAG.

% PAAG	Xylene cyanol	Bromphenol blue
20	~28	~8
15	~30	~9-10
12	~40	~11
10	~55	~12
8	~76	~19
6	~106	~26
5	~130	~35

п. 17.

Оба метода имеют приблизительно равную чувствительность.

Метиленовый синий можно использовать в концентрации 0.0002-0.04%, чем меньше концентрация красителя, тем дольше идёт окрашивание, но тем короче отмывка. AcONa (pH 5.2) введен, по-видимому, для фиксации олигонуклеотидов в геле. Но быстро окрасить можно и в воде. Окрашивание метиленовым синим легко обратимо. Нужно следить и выбирать для фотографирования оптимальный момент.
В качестве флуоресцирующей пластинки можно (лучше) использовать хромотографическую пластинку: /Merck, Art. 5735, DC-Plastikfolien Kieselgel 60 F₂₅₄ 25 Folien 20x20cm/, усиливающий рентгеновский экран или любую флуоресцирующую поверхность. Удобно запаять пластинку в UV прозрачный пакет (и никогда ее оттуда не вынимать).

Еще один удобный способ - окрашивание Etidium Bromide. В гель и буфер нужно добавить EtBr до 0.5µg/ml. Но! Окрашивание EtBr имеет чувствительность ~ Met. Синего лишь для олигонуклеотидов ds > 20bp; ss > 40b. Чувствительность методов окрашивания [µg]:

		Met.синий	Et Br
ss	16 b	0.05	10
	20 b	0.05	1
	40 b	0.05	0.01
ds	16 bp	0.05	0.1
	20 bp	0.05	0.05
	40 bp	0.005-0.01	0.005-0.01

Примечание.

Подвижность красителей в неденатурирующемPAAG.

% PAAG	Xylene cyanol	Bromphenol blue
20	45	12
15	60	15
12	70	20
8	160	45
5	260	65
3.5	460	100

> Методы > Олигонуклеотиды > PAAG электрофорез. Форез олигонуклеотидов.		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
Подготовка форезного аппарата. Количество олигонуклеотидов на дорожку. Выбор % геля. Форез. После фореза. Растворы. TBE PSA Стоковый раствор акриламида 40% 2% агароза в ТВЕ Смесь для окрашивания 2хбуфер для нанесения Комментарии. Общие. По пунктам. Подвижность красителей в денатурирующем PAAG. Подвижность красителей в неденатурирующем PAAG.
Подготовка форезного аппарата. вымыть камеры детергентом, хорошо ополоснуть; мыть стекла детергентом (если очень грязные или из сомнительного источника - хромпиком); если хочется, чтобы гель легко снимался со стекол - силиконизировать (достаточно 1 раз на ~10 прогонов).