Состав PCR реакции | Практическая молекулярная биология

Комментарии.

По отдельным компонентам.

Буфер.

Tris Cl. Высокое значение рН берется из-за того, что при повышении температуры рН Tris-буфера падает (температурный коэффициент ~ -0.031^{ед. рН}/^oC) и при 72^oС составляет ~7.5.
KCl. Средние концентрации KCl стимулируют на 40-60% активность Taq полимеразы (но 0.2M - полностью ингибирует полимеразную активность).
Triton X-100. Предотвращает адсорбцию белка на поверхности пробирки.

MgCl₂.

Диапазон рабочих концентраций: 0.5-5.0mM (10mM - ингибирует полимеразу на 40-50%). Увеличение концентрации Mg²⁺ оказывает очень резкое влияние на специфичность и эффективность PCR: увеличивается выход, но более высокими темпами уменьшается специфичность. Оптимум зависит от последовательностей матрицы и праймеров.

Т.о. слишком низкая концентрация Mg²⁺ - низкий выход, слишком высокая - множество полос неспецифической амплификации.

На молекулярном уровне: Mg²⁺ образует комплексы с dNTP’s (именно эти комплексы являются субстратом для Taq pol). C Mg²⁺ стехиометрически связываются dNTP’s, PPi, EDTA, PO₄. Повышение концентрации Mg²⁺ вызывает повышение температуры плавления DNA.

dNTP’s.

Важно поддерживать концентрацию значительно выше, чем Km соответствующей полимеразы. Меньшие концентрации dNTPs - более высокая точность синтеза. Диапазон используемых концентраций 50-500 µM.
Количество: Если в 100µl реакции включится 50% dNTP’s, то количество продукта составит: m=50[%]x4[dNTP’s]x50[µM]x300[^g/_M]x100[µl]=3µg.
Важно иметь ввиду, что, т.к. dNTP’s обладают значительной буферной емкостью, сток dNTP’s должен иметь нейтральный рН.
Приготовление стока - "Однокомпонентные растворы".

Primer’s.

Необходимое для реакции количество праймера совсем несложно оценить: если в 100µl будет синтезировано 3µg 500bp продукта, то на это должно пойти праймера: m=3[µg]/{300[g/M]x500[bp]x2[цепи]}=10pmol. Используемый диапазон концентраций: 0.1-0.6 µM.
Лучше, если пара "сбалансирована", т.е. разница температур плавления не превышает 2-4^oС.
A-T - клонирование.

Мы всегда полагали, что Taq-pol добавляет А к любому тупому концу, но есть статья, где сообщается, что это зависит от 3'-конца. Добавляется:

G - если на 3'-конце G;
A - если на 3'-конце C, T, A, причем весьма плохо, если последний нуклеотид A.
=> Лучше, если праймеры не начинаются на С или Т.

Хранение: иногда при длительном хранении на 4^oС (или после большого количества замораживаний-оттаиваний) праймер "портится" - PCR с его участием даёт очень низкий выход. Мы не знаем, что при этом происходит, но проблема вполне решается 3х минутным кипячением и резким охлаждением.

Polymerase.

Свойства различных полимераз описаны в "Свойства DNA полимераз".
Количество.

Taq pol.

Если используется слишком маленькое количество Taq, выход продукта снижается, причем это снижение тем серьезнее, чем больше размер продукта. Не стоит использовать и слишком большой избыток Taq pol. При этом вначале появляются высоко- и низкомолекулярные шмеры (превышение ~2-4 раза), а затем весь продукт становится чрезвычайно маленьким (превышение ~4-16 раз).

Pfu pol.

Оптимум концентраций для Pfu polymerase существенно уже, чем для Taq. В случае (весьма редком), когда требуется провести амплификацию с Pfu pol. мы предпочитаем сразу ставить небольшой ряд разведений.

Для рутинного использования мы предпочитаем смесь Taq:Pfu=100:1. Судя по литературе у неё практически такая же, как у Pfu, точность синтеза, и мы убедились, что она не уступает Taq pol. в удобстве использования.
Стоит отметить, что полимераза - самый дорогой компонент реакции (если покупать коммерческую), и в то же время его совсем не сложно приготовить в лабораторных условиях и превратить в самый дешевый.
1u Taq соответствует 43fmol белка (для Ampli Taq "Perkin-Elmer"). Ampli Taq. 250 000u - 1 mg, 1u -> 4ng, Mw=94kDa, => 1u=4ng/94 000Da=43x10^-3pmol=43fmol.
Taq pol. обладает 5'-3' экзонуклеазной активностью. Эта активность может вызвать проблемы, связанные с деградацией 5' концов продукта.
Точность Taq-pol зависит от концентрации Mg²⁺, dNTP’s, сбалансированности dNTP’s, pH. В среднем, частота ошибок чуть ниже, чем 1 замена на 100-300bp.

Хорошо известно, что из-за того, что Taq полимераза с высокой частотой включает неправильные нуклеотиды для правильного определения последовательности нужно сиквенировать не одну клонированную матрицу, а несколько. Но!!! Это касается только клонированных PCR-продуктов. Если PCR-продукты сиквенировать непосредственно, то последовательность получается точной, т.к. для того, чтобы обнаружить мутацию, она должна присутствовать в >10% матриц. Это возможно лишь в том случае, если мутация произошла в первом цикле, а матриц при этом было не более 5 штук.

Матрица.

PCR продукт.

Достаточно ~ 22-25 циклов, чтобы довести PCR до насыщения, если матрица - другой PCR-продукт, разбавленный в ~ 10⁶раз (учитывая и финальное разведение в самой реакции: например, развести PCR продукт в 16 000 раз и использовать 1µl разведения на 30 µl новой PCR-реакции). Внимание! Такие разведения требуют использования какого-либо агента, предотвращающего неспецифическую сорбцию на стенках пробирки: tRNA или какой-либо совместимой с PCR реакцией DNA в концентрациях ~ 0.1µg/ml.

Если используется :

геномная DNA млекопитающих => <0.5-1µg;
геномная DNA бактерий => ~1-10ng;
DNA фага лямбда => достаточно 1µl из 200µl элюции одиночной бляшки;
плазмидная DNA =>

0.1-1.0µl ночной культуры,
совсем небольшое (на зубочистке) количество материала колонии;
~50ng очищенной суперскрученной DNA (такое большое количество берется из-за того, что pDNA - кольцевая и при понижении температуры она ренатурирует, не оставляя праймеру шанса связаться с ней. Если хочется уменьшить количество вносимой pDNA, нужно проводить предварительную щелочную денатурацию:

pDNA (V<~4µl) в ТЕ, + 1µl 1N NaOH;
65-85^oC, 5' ;
резко охладить до 0^oС или заморозить:
+ 1µl 1N HCl.

Если DNA перед реакцией переосаждается спиртом, то в качестве соли лучше всего использовать NH₄Ac (NaAc может ингибировать PCR-реакцию).

Буфер для внесения.

Мы обнаружили, что добавление 5x буфера с сахарозой улучшает результаты PCR, не сказываясь существенно на температурах отжига праймеров (по видимому, за счёт стабилизации фермента). Очень удобно использовать буфер, если требуется поставить одновременно целый ряд PCR- реакций, а затем проанализировать их на форезе. Сахароза делает раствор достаточно плотным для непосредственного нанесения, а Крезоловый красный служит цветным маркером (подробности "Агарозный гель-электрофорез").
3.33x буфер с бетаином оказывает очень заметное стабилизирующее влияние на реакцию (суппрессируется действие различных ингибиторов, температуры плавления различных матриц становятся более близкими). Но нужно иметь в виду, что бетаин заметно снижает критическую температуру отжига праймеров (добавление сахарозы её не изменяет). В случае праймер-пары M-13/23 & M-13/30 T_a^max снизилась с 71^oС до 67^oС при добавлении бетаина до 1.5M. Кроме того, если использовать 65-72^oС как температуру полимеризации, то будут проблемы с A-T богатыми матрицами (мы пользуемся субциклами 59/65^oC).