Приготовление Т-вектора | Практическая молекулярная биология

Приготовление вектор/EcoRV.

собрать смесь:

вектор => 10µg
"B" буфер^(10х) => 20µl
BSA^(10х) => 20µl
EcoRV => ~20u
H₂O => до 200µl

37^oC, 1-2h;
2µl на форез - проконтролировать полноту рестрикции;
экстракция 200µl Ф:Х, Х;
добавить

NaCl (5M) => 8µl
EtOH 96% => 500µl

N.T. 10';
ЦФ NT, 10';
сполоснуть 70% EtOH;
растворить в 88µl H₂O.

T-extension.

добавить

Taq buffer (c 2.5mM MgCl₂) => 10µl
dTTP (100mM) => 2µl
Taq pol => 5u

72^oC, 2h;
охладить до NT, экстрагировать Ф:Х, Х;

NaCl (5M) => 4µl,
EtOH (96%) => 250µl;

NT, 10';
ЦФ NT, 10';
сполоснуть 70% EtOH;
растворить в 45µl H₂O.

Самолигирование.

добавить

T4 lig. buf.^(10х) => 5µl,
T4 DNA lig. => 2u;

16^oC, ON;
препаративный форез в 0.8% агарозе;
выделить незалигировавшуюся pDNA в PEG;
разаликвотить по 15µl, хранить при -20^oС.

> Методы > PCR > Клонирование PCR продуктов. Приготовление Т-вектора.		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
Приготовление вектор/EcoRV. T-extension. Самолигирование. Комментарии. Общие.	Для приготовления Т-вектора используется вектор, разрезанный рестриктазой EcoRV, дающей тупые концы. Инкубация с Taq pol. и dTTP добавляет 3'-концевую Т. Самолигирование изменяет размер тех молекул вектора, которые по каким-либо причинам не приобрели 5'-концевую Т. Размер молекул с двумя 3'-концевыми Т не изменяется и это позволяет очистить их с помощью препаративного электрофореза.
Приготовление вектор/EcoRV. собрать смесь: вектор => 10µg "B" буфер^(10х) => 20µl BSA^(10х) => 20µl EcoRV => ~20u H₂O => до 200µl 37^oC, 1-2h; 2µl на форез - проконтролировать полноту рестрикции; экстракция 200µl Ф:Х, Х; добавить NaCl (5M) => 8µl EtOH 96% => 500µl N.T. 10'; ЦФ NT, 10'; сполоснуть 70% EtOH; растворить в 88µl H₂O. T-extension. добавить Taq buffer (c 2.5mM MgCl₂) => 10µl dTTP (100mM) => 2µl Taq pol => 5u 72^oC, 2h; охладить до NT, экстрагировать Ф:Х, Х; NaCl (5M) => 4µl, EtOH (96%) => 250µl; NT, 10'; ЦФ NT, 10'; сполоснуть 70% EtOH; растворить в 45µl H₂O. Самолигирование. добавить T4 lig. buf.^(10х) => 5µl, T4 DNA lig. => 2u; 16^oC, ON; препаративный форез в 0.8% агарозе; выделить незалигировавшуюся pDNA в PEG; разаликвотить по 15µl, хранить при -20^oС.