Окрашивание белковых гелей Coomassie R250 с метанолом | Практическая молекулярная биология

Комментарии.

Общие.

Чувствительность 0.1-1.0µg белка на бэнд.
Метод не очень чувствителен, и вполне возможно работать с гелем без перчаток. Но мы не советуем этого делать, если Вам не хочется, чтобы в транспорте косились на Ваши синие пальцы.
При окрашивании фон возникает из-за SDS и буфера, если их предварительно отмыть фон получится существенно слабее:

* отмыть гель в 2^х сменах большого объёма 5mM HCl (каждая смена ~1h);
* далее - окраска как обычно.

По пунктам.

п. 1.

Скорость окрашивания зависит от температуры. При 60-65^oС достаточно <1h. Внимание (!!!) горячее окрашивание можно проводить только под тягой: пары метанола сильно ядовиты.

п. 4.

Отмывка идет существенно быстрее при повышенной температуре. Но(!) при этом за ней нужно следить, иначе можно смыть не только фон, но и специфический сигнал (если всё же не уследили, окрашивание можно повторить). Внимание (!!!) горячую отмывку можно проводить только под тягой: пары метанола сильно ядовиты.
Бутанол вытягивает краситель из водной фазы. Двухфазный Destaining solution гораздо удобнее, чем однофазный или двухфазный с поглотителями. Отмывка существенно быстрее, раствор служит гораздо дольше.
Destaining solutions I и II различаются только названиями. Destaining solution I применяется первым (предварительная отмывка), он более грязный. Destaining solution II (финальная отмывка) - чище. Когда бутанол в Destaining solution I становится совсем грязным, его выбрасывают (удобнее отсосать вакуумным насосом); на его место переливают бутанол из Destaining solution II, который, в свою очередь, заменяют свежим бутанолом (или просто переобозначают раствор "II" в "I").

п. 5.

Удобство в том, что без уксусной, без метанола, и гораздо быстрее. Результат - как при стандартной отмывке, может, фон чуть погуще. Растрескивание при сушке обычное. Мы так отмываем уже года два, оригинальная ссылка на: G.Hervieu. A quick and safe method for destaining Coomassie-Blue-stained protein gels. Technical Tips Online.

п. 6.

Обычно гель сушат (т.к., если человек умеет фотографировать, то лучше пользоваться Zn/имдазол методом: он существенно быстрее и чувствительнее).
Есть два пути решения проблемы растрескивания гелей при сушке (обычно это касается только высокопроцентных гелей):

инкубировать гель перед сушкой или ~1h в 20% глицерине, или ~30' в ацетоне.
использовать более мощный вакуумный насос.

> Методы > Работа с белками > Окрашивание гелей Кумасси R250 с метанолом. Окрашивание белковых гелей Coomassie R250 с метанолом.		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
Растворы. Staining solution Destaining solution Комментарии. Общие. По пунктам.	Метод наименее чувствительный (по сравнению с серебряным окрашиванием или окрашиванием Zn/имидазолом). Его делают популярным два сравнительных преимущества: (i) он проще и несравненно дешевле, чем серебряное окрашивание; (ii) в отличие от окрашивания Zn/имидазолом, гель можно высушить и сохранить.
поместить гель в ~ 5V Staining solution на ~ 4h (лучше с покачиванием); убрать Staining solution (его можно использовать несколько раз); быстро сполоснуть гель H₂O; отмывать в двух сменах Destaining solution: Destaining solution I ~ 20'-2h (в зависимости от температуры), Destaining solution II ~20'-2h; альтернативный метод отмывки (Дмитрий Жарков) гель кладется в широкую стеклянную посудинку с холодной водой (200-300 ml), и кипятится ~5' (или до желаемой прозрачности); гель либо фотографировать, либо сушить.