Очистка His6-меченного белка на Ni-NTA колонке | Практическая молекулярная биология

Приготовление стоковой культуры.

со стока (-70^oС) рассеять бактерии штрихом на чашку с селективной средой: {2xYT, Amp 100 µg/ml, Glucose 2%};
отобрать 2-3 индивидуальные колонии, поместить их в 5ml среды {2xYT, Amp 100 µg/ml, Glucose 2%} в 17-50ml пробирках;
растить 200-300rpm, 30(37)^oC, ON;
из каждой пробирки отобрать в стерильных условиях по 1ml;
к оставшимся частям культуры добавить DMSO до 7%, разаликвотить по 500 µl в подписанных 1.5ml ЦФ-пробирках, заморозить в жидком азоте, хранить при -70^oC;
аликвоты из п.4 2х промыть 1.0ml 2xYT;
ресуспензировать в 2ml среды {2xYT, Amp 100 µg/ml, IPTG 40 µM};
отобрать по 200 µl (не индуцированный контроль);
остальная часть 200-300rpm, 37^oC, ~5h;
отобрать по 200 µl (индуцированный контроль);
проверить экспрессию рекомбинантного белка на PAAG электрофорезе (15% разрешающий гель);

Препаративная культура.

разморозить аликвоту из п.5, перенести её в 1L среды {2xYT, Amp 100 µg/ml, Glucose 2%} в по крайней мере двух 2L колбах;
200-300rpm, 37^oC, до OD₆₀₀=0.6-0.8 (но ниже 1.0!);
ЦФ 4krpm, 10', NT;
2x промыть клетки 100ml 2xYT (ЦФ 4krpm, 10', NT);
ресуспензировать в 1L среды {2xYT, Amp 100 µg/ml, IPTG 40 µM};
optional

отобрать 1ml (не индуцированный контроль), переосадить, ресуспензировать в 200 µl 1х буфера для внесения;

200-300rpm, 37^oC, 5h;
optional

отобрать 1ml (индуцированный контроль), переосадить, ресуспензировать в 200 µl 1х буфера для внесения;

ресуспензировать клетки в ~100ml Lysis buffer (LB), перенести в 50ml центрифужные пробирки;
ЦФ 4krpm, ~5', 4^oC;
сбросить супернатант, взвесить осадки, ресуспензировать их в LB из расчёта 4ml на 1g осадка;
заморозить в жидком азоте, хранить при -70^oС;
проверить экспрессию рекомбинантного белка на PAAG электрофорезе;

Приготовление осветлённого лизата.

разморозить клетки во льду ~15';
добавить лизоцим до 1mg/ml, 30', 0^oС;
озвучить во льду (6х 200-300W с 0.5-1.0' перерывами для охлаждения между импульсами);
отобрать 0.1ml (контроль перед центрифугированием);
ЦФ 10krpm, ~30', 4^oC;
забрать супернатант, отобрать 0.5ml для определения количества e(y)2/mouse белка, остальное заморозить в жидком азоте, хранить при -70^oС;

Определение количества e(y)2/mouse белка и ёмкости Ni-NTA агарозы.

сполоснуть 0.1ml 50% Ni-NTA агарозы 2х 0.5ml LB, ресуспензировать в исходном объёме но уже LB буфера;
поставить аналитическую адсорбцию:

10 µl 50% Ni-NTA + 10 µl супернатанта из п.30 + 150 µl LB;
10 µl 50% Ni-NTA + 40 µl супернатанта из п.30 + 120 µl LB;
10 µl 50% Ni-NTA + 160 µl супернатанта из п.30;

смешивать 1h при +4^oC (холодная комната) на роторном смесителе;
снять супернатант, 2х сполоснуть 0.5ml WB, снять белок с агарозы в 50 µl 100mM EDTA;
1. сравнить выход белка окрашиванием на Whatman 3MM, нанеся 2х кратные разведения;
2. определить концентрации белка в элюциях (а)-(в) с помощью Bicinchoninic acid protein assay kit (Но, внимание!!! Нельзя использовать больше, чем 1 µl, т.к. 10mM EDTA - предельная допустимая концентрация для этой процедуры);
рассчитать, какой объём супернатанта можно очистить на 2ml 50% Ni-NTA и какое количество белка ожидается с этого получить;

Препаративная очистка.

Нанесение на колонку.

сполоснуть 2ml 50% Ni-NTA агарозы 2х 4ml LB, ресуспензировать в исходном объёме но уже LB буфера;
поставить адсорбцию:

2ml 50% Ni-NTA агарозы
"?"ml супернатанта (из расчёта п.33)
"?"ml LB (чтобы сохранялась пропорция п.29);

1h при +4^oC (холодная комната) на роторном смесителе;
нанести лизат на 1ml Qiagen-колонку, собрать то, что прошло сквозь колонку;
лучше прикрыть Ni-NTA агарозу в колонке верхним штифтом;
промыть колонку 10ml LB, собрать то, что прошло сквозь колонку;
промыть колонку 10ml WB, забрать последний ~1ml из тех, что прошли сквозь колонку;

В протоколе не представлена оптимизация способа элюции с колонки. Её нужно проводить при первой очистке любого белка. При этом белок элюируется градиентом концентрации имидазола (или pH), фракции анализируются на PAAG и подбирается оптимальный состав WB и EB.

Элюция имидазолом.

промыть колонку 3ml I-WB, собирать фракции по 0.5ml;
элюировать белок 3ml I-EB, собирать фракции по 0.5ml;

Элюция кислым буфером.

промыть колонку 3ml A-WB, собирать фракции по 0.5ml;
элюировать белок 3ml A-EB, собирать фракции по 0.5ml;
проанализировать на форезе ход очистки, объединить фракции элюата, содержащие основное количество рекомбинантного белка, определить выход белка;
если не требуется вносить коррективы - вымыть Ni-NTA агарозу из колонки и провести очистку оставшегося осветлённого лизата;
определить количество и качество белка в индивидуальных раундах очистки, подписать пробирки, заморозить в ж. азоте, хранить на -70^oС.
регенерировать Ni-NTA агарозную колонку, подписать когда и для очистки какого белка она использовалась, хранить на +4^oС.

Регенерация Ni-NTA агарозы (для 1ml колонки).

промыть колонку 4ml RB;
промыть колонку 5ml H₂O;
промыть колонку 3ml 2% SDS;
промыть колонку 1ml 25% EtOH;
промыть колонку 1ml 50% EtOH;
промыть колонку 1ml 75% EtOH;
промыть колонку 5ml 100% EtOH;
промыть колонку 1ml 75% EtOH;
промыть колонку 1ml 50% EtOH;
промыть колонку 1ml 25% EtOH;
промыть колонку 1ml H₂O;
промыть колонку 5ml 100mM EDTA, pH8.0;
тщательно промыть колонку 20ml H₂O;
перезарядить колонку 2ml 100mM NiSO₄
промыть колонку 2ml H₂O;
промыть колонку 2ml 25% EtOH;
заполнить колонку до половины 25% EtOH;
хранить при +4^oС.

Комментарии.

Общие.

Как и любой другой белок, ey2 нужно чистить при +4^oС, т.е. в холодной комнате.

По пунктам.

п. 1-11.

Клон-продуцент может быть нестабилен, поэтому необходим этап селекции.

п. 1.

2% глюкоза выступает здесь как репрессор lac промотора (под контролем которого находится экспрессируемый ген). Катаболитная репрессия - хоть и очень простой метод, но вполне действенный: на чашках с 2% глюкозой сине-белый тест не работает.

п. 3.

Инкубация при 30^oС - чтобы культура не перерастала.

п. 6.

Промывка 2xYT, чтобы перед индукцией избавиться от глюкозы. 2х промывка проводится следующим образом:

поместить 1ml культуры в стерильную 1.5ml ЦФ-пробирку;
ЦФ либо 2' при 6krpm (в микроцентрифуге с регулируемой скоростью вращения), либо 10'' при 14krpm;
убрать супернатант, бактерии ресуспензировать на вортексе в 1.0ml 2xYT;
повторить: п.2, 3;

п. 8, 10.

Отобранные 200 µl осадить на ЦФ (10-30'') и ресуспензировать в 20 µl {1х буфера для внесения}. Чтобы не образовывалось трудно растворимых комков лучше вначале ресуспензировать в 10 µl H₂O, а потом добавить 10 µl 2х буфера.

п. 9, 18.

Время индукции можно увеличить в ~два раза, но это не приведёт к увеличению количества рекомбинантного белка.

п. 11.

Чтобы получить нормальную картинку достаточно взять 3 µl на 2.5х0.75mm² форезную ячейку. Но, в первый раз мы бы посоветовали наносить образцы на гель тремя блоками:

3х количество => 9 µl;
1х количество => 3 µl;
0.3х количество => 1 µl.

В этом случае вы наверняка получите хорошую картинку хотя бы на одном из блоков. Количество материала, которое даст приемлемую картинку на форезе можно так же оценить с помощью предварительной окраски серийных разведений на Whatman 3MM.

На форезе вы должны увидеть жирную полосу (~20% от всего белка на дорожке) в районе 10kDa.

п. 15.

Отмывку проводить в металлических ЦФ стаканах. Перед этим стаканы и пластиковые крышки тщательно вымыть, протереть спиртом и высушить под UV(стерилизация). Ресуспензирование и т.п. проводить на столе (не под ламинаром), но нужно делать это чисто.

п. 22.

Сбрасывать супернатант в два этапа: сначала слить, провести повторное центрифугирование ~1-2', остатки жидкости отсосать.

п. 25.

Можно размораживать и в бане при комнатной температуре, НО!!! С непрерывным перемешиванием и перенести в ледяную баню, когда в пробирке ещё останется ~10% льда.

п. 27.

Раствор должен стать слабо вязким после озвучивания.

п. 34.

При споласкивании Ni-NTA её можно осаждать низкоскоростным центрифугированием:

для микроцентрифуги - 30'' при 3krpm;
для препаративной центрифуги - 2' при 2krpm.

п. 37.

В пределах ёмкости Ni-NTA агарозы количество полученного белка должно увеличиваться пропорционально исходному количеству.
Только для ориентировки!: у нас получалось ~80 µl супернатанта на 10 µl 50% Ni-NTA агарозы.

п. 37.

Предварительно залить в колонку ~5ml LB, дать стечь.

п. 41.

Верхний штифт вводить либо перевернутым желтым типом, либо обрезанной 1ml пипеткой.

п. 48.

На форез нужно нанести

а) материал из пунктов 28, 30, 37, 39, 40,
б) равные объёмы (~1 µl) из фракций пунктов 41, 42 или 43,44.

Объёмы материала из п. 28, 30, 37, 39, 40 нужно скорректировать с учётом разбавления в п.35.
Например, если 10 µl 50% Ni-NTA агарозы связывают количественно рекомбинантный белок из 80 µl супернатанта: адсорбция:

2ml 50% Ni-NTA агарозы
16ml супернатанта
16ml LB

=> объёмы из п. 37, 39, 40 в 2.1 раза больше, чем из п. 28, 30.

п. 49.

Для экономии времени в следующих раундах, очистку можно контролировать не на форезе, а по окрашиванию аликвот на Whatman 3MM.
Рекомбинантный белок, очищенный в каждом раунде нужно объединить в отдельной пробирке, для каждой определить концентрацию белка (Bicinch. kit) и проконтролировать его качество на отдельной дорожке PAAG. Лишь когда качество индивидуальных очисток будет проконтролировано на форезе, можно объединить материал в одной пробирке.

Экспрессирующая конструкция.

Открытая рамка считывания мышиного e(y)2 гена клонирована по BamHI-HindIII сайтам в pQE30 вектор (Qiagen); аминокислотная последовательность рекомбинантного белка:

MOUSE E(Y)2 PROTEIN, RECOMBINANT,
EXPRESSED IN E.COLY AS 6HIS FUSION
SEQUENCE 113 AA; 12927 MW;

MRGSHHHHHH GSMVVSKMNK DAQMRAAINQ KLIETGERER LKELLRAKLI ECGWKDQLKA
HCKEVIKEKG LEHVTVDDLV AEITPKGRAL VPDSVKKELL QRIRTFLAQH ASL

> Методы > Экспрессия белков > His₆-меченные белки. Очистка His₆-меченного белка на Ni-NTA колонке (e(y)2/mouse).		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
Приготовление стоковой культуры. Препаративная культура. Приготовление осветлённого лизата. Определение количества e(y)2/mouse белка и ёмкости Ni-NTA агарозы. Препаративная очистка. Нанесение на колонку. Элюция имидазолом. Элюция кислым буфером. Регенерация Ni-NTA агарозы (для 1ml колонки). Растворы. Lysis buffer (LB) Wash buffer (WB) Imidazole wash buffer (I-WB) Imidazole elution buffer (I-EB) Acid wash buffer (A-WB) Acid elution buffer (A-EB) Regeneration buffer NiSO₄1M Комментарии. Общие. По пунктам. Экспрессирующая конструкция.
Приготовление стоковой культуры. со стока (-70^oС) рассеять бактерии штрихом на чашку с селективной средой: {2xYT, Amp 100 µg/ml, Glucose 2%}; отобрать 2-3 индивидуальные колонии, поместить их в 5ml среды {2xYT, Amp 100 µg/ml, Glucose 2%} в 17-50ml пробирках; растить 200-300rpm, 30(37)^oC, ON; из каждой пробирки отобрать в стерильных условиях по 1ml; к оставшимся частям культуры добавить DMSO до 7%, разаликвотить по 500 µl в подписанных 1.5ml ЦФ-пробирках, заморозить в жидком азоте, хранить при -70^oC; аликвоты из п.4 2х промыть 1.0ml 2xYT; ресуспензировать в 2ml среды {2xYT, Amp 100 µg/ml, IPTG 40 µM}; отобрать по 200 µl (не индуцированный контроль); остальная часть 200-300rpm, 37^oC, ~5h; отобрать по 200 µl (индуцированный контроль); проверить экспрессию рекомбинантного белка на PAAG электрофорезе (15% разрешающий гель); Препаративная культура. разморозить аликвоту из п.5, перенести её в 1L среды {2xYT, Amp 100 µg/ml, Glucose 2%} в по крайней мере двух 2L колбах; 200-300rpm, 37^oC, до OD₆₀₀=0.6-0.8 (но ниже 1.0!); ЦФ 4krpm, 10', NT; 2x промыть клетки 100ml 2xYT (ЦФ 4krpm, 10', NT); ресуспензировать в 1L среды {2xYT, Amp 100 µg/ml, IPTG 40 µM}; optional отобрать 1ml (не индуцированный контроль), переосадить, ресуспензировать в 200 µl 1х буфера для внесения; 200-300rpm, 37^oC, 5h; optional отобрать 1ml (индуцированный контроль), переосадить, ресуспензировать в 200 µl 1х буфера для внесения; ресуспензировать клетки в ~100ml Lysis buffer (LB), перенести в 50ml центрифужные пробирки; ЦФ 4krpm, ~5', 4^oC; сбросить супернатант, взвесить осадки, ресуспензировать их в LB из расчёта 4ml на 1g осадка; заморозить в жидком азоте, хранить при -70^oС; проверить экспрессию рекомбинантного белка на PAAG электрофорезе; Приготовление осветлённого лизата. разморозить клетки во льду ~15'; добавить лизоцим до 1mg/ml, 30', 0^oС; озвучить во льду (6х 200-300W с 0.5-1.0' перерывами для охлаждения между импульсами); отобрать 0.1ml (контроль перед центрифугированием); ЦФ 10krpm, ~30', 4^oC; забрать супернатант, отобрать 0.5ml для определения количества e(y)2/mouse белка, остальное заморозить в жидком азоте, хранить при -70^oС; Определение количества e(y)2/mouse белка и ёмкости Ni-NTA агарозы. сполоснуть 0.1ml 50% Ni-NTA агарозы 2х 0.5ml LB, ресуспензировать в исходном объёме но уже LB буфера; поставить аналитическую адсорбцию: 10 µl 50% Ni-NTA + 10 µl супернатанта из п.30 + 150 µl LB; 10 µl 50% Ni-NTA + 40 µl супернатанта из п.30 + 120 µl LB; 10 µl 50% Ni-NTA + 160 µl супернатанта из п.30; смешивать 1h при +4^oC (холодная комната) на роторном смесителе; снять супернатант, 2х сполоснуть 0.5ml WB, снять белок с агарозы в 50 µl 100mM EDTA; сравнить выход белка окрашиванием на Whatman 3MM, нанеся 2х кратные разведения; определить концентрации белка в элюциях (а)-(в) с помощью Bicinchoninic acid protein assay kit (Но, внимание!!! Нельзя использовать больше, чем 1 µl, т.к. 10mM EDTA - предельная допустимая концентрация для этой процедуры); рассчитать, какой объём супернатанта можно очистить на 2ml 50% Ni-NTA и какое количество белка ожидается с этого получить; Препаративная очистка. Нанесение на колонку. сполоснуть 2ml 50% Ni-NTA агарозы 2х 4ml LB, ресуспензировать в исходном объёме но уже LB буфера; поставить адсорбцию: 2ml 50% Ni-NTA агарозы "?"ml супернатанта (из расчёта п.33) "?"ml LB (чтобы сохранялась пропорция п.29); 1h при +4^oC (холодная комната) на роторном смесителе; нанести лизат на 1ml Qiagen-колонку, собрать то, что прошло сквозь колонку; лучше прикрыть Ni-NTA агарозу в колонке верхним штифтом; промыть колонку 10ml LB, собрать то, что прошло сквозь колонку; промыть колонку 10ml WB, забрать последний ~1ml из тех, что прошли сквозь колонку; В протоколе не представлена оптимизация способа элюции с колонки. Её нужно проводить при первой очистке любого белка. При этом белок элюируется градиентом концентрации имидазола (или pH), фракции анализируются на PAAG и подбирается оптимальный состав WB и EB. Элюция имидазолом. промыть колонку 3ml I-WB, собирать фракции по 0.5ml; элюировать белок 3ml I-EB, собирать фракции по 0.5ml; Элюция кислым буфером. промыть колонку 3ml A-WB, собирать фракции по 0.5ml; элюировать белок 3ml A-EB, собирать фракции по 0.5ml; проанализировать на форезе ход очистки, объединить фракции элюата, содержащие основное количество рекомбинантного белка, определить выход белка; если не требуется вносить коррективы - вымыть Ni-NTA агарозу из колонки и провести очистку оставшегося осветлённого лизата; определить количество и качество белка в индивидуальных раундах очистки, подписать пробирки, заморозить в ж. азоте, хранить на -70^oС. регенерировать Ni-NTA агарозную колонку, подписать когда и для очистки какого белка она использовалась, хранить на +4^oС. Регенерация Ni-NTA агарозы (для 1ml колонки). промыть колонку 4ml RB; промыть колонку 5ml H₂O; промыть колонку 3ml 2% SDS; промыть колонку 1ml 25% EtOH; промыть колонку 1ml 50% EtOH; промыть колонку 1ml 75% EtOH; промыть колонку 5ml 100% EtOH; промыть колонку 1ml 75% EtOH; промыть колонку 1ml 50% EtOH; промыть колонку 1ml 25% EtOH; промыть колонку 1ml H₂O; промыть колонку 5ml 100mM EDTA, pH8.0; тщательно промыть колонку 20ml H₂O; перезарядить колонку 2ml 100mM NiSO₄ промыть колонку 2ml H₂O; промыть колонку 2ml 25% EtOH; заполнить колонку до половины 25% EtOH; хранить при +4^oС.