Поверка взаимодействия двух белков на глутатион сефарозе.

Отмыть 50µl глютатион-сефарозы два раза по 500µl LB;
На последней отмывке разделить на две части, убрать супер;
Поставить связывание:

глютатион-сефароза одна часть из п.2

GST 30µg

LB до 600µl;
Поставить связывание:

глютатион-сефароза одна часть из п.2

GST-proteinA 50-100µg

LB до 600µl;
Инкубировать на ротаторе 30', RT;
Открутить, сохранить 10µl супера из каждой пробирки, остальной супер выкинуть;
Отмыть 600mkl LB;
Отмыть 600mkl IP100;
Отмыть 600mkl IP500, 5' на ротаторе;
Отмыть 600mkl IP100;
Поставить взаимодействие: (негативный контроль)

смола со связанным белком GST

ProteinB 20-100µg

IP100 до 600µl;
Поставить взаимодействие: (эксперимент)

смола со связанным белком GST-ProteinA

ProteinB 20-100µg

IP100 до 600µl;
Инкубировать на ротаторе 1.5h, RT;
Открутить, сохранить 10µl супера из каждой пробирки, остальной супер выкинуть;
Отмыть 600mkl IP100;
Отмыть 600mkl IP500, 5' на ротаторе;
Отмыть 600mkl IP500, 5' на ротаторе;
Отмыть 600mkl IP500, 5' на ротаторе;
Отмыть 600mkl IP100;
Аккуратно удалить остатки жидкости из смолы;
К смоле добавить 15µl 2x краски для нанесения;
К образцам из пп. 6, 14 добавить по 10µl 2x краски для нанесения;
Прокипятить и нанести по 10µl всех образцов на PAAG. Элюции эксперимента и негативного контроля из п.21 нанести на соседние дорожки;
В элюции негативного контроля не должно быть белка ProteinB, а толко GST;
В элюции эксперимента должны быть белки ProteinB и GST-ProteinA;