Иммуноокрашивание срезов имаго (дрозофила) | Практическая молекулярная биология

Приготовление препаратов.

приготовить 5-7µm срезы (см. "Фиксация и заливка в парафин (дрозофила)."), перенести кисточкой на предметное стекло в каплю воды;
сушить в термостате 37^oС, ON.

Иммуноокрашивание.

депарафинировать в гистологических стаканах:

ксилол (I) => 5'
ксилол (II) => 5'
ксилол:EtOH (100%) (1:1) => 2'
EtOH (100%) (I) => 1'
EtOH (100%) (II) => 1'
EtOH (96%) => 1'
EtOH (70%) (I) => 1'
EtOH (70%) (II) => 1'
H₂O (mQ) => 1';

накапливать в стеклоприёмнике mQ, >2';
инкубировать 2х 5' в TBS в 100ml стеклоприемнике;
15' в TBSTB в 100ml стеклоприемнике;
приготовить разведение первичных антител в TBSTB из расчета 100-150µl на стекло;
убрать фильтровалкой жидкость вокруг срезов (осторожно!) и нанести разведенные первичные антитела (~100-150µl на стекло);
инкубировать при NT 2h во влажной камере;
отмыть 2х10' в TBSTB в 100ml стеклоприемнике;
приготовить разведения вторичных антител из расчета 100-150µl на стекло.;
убрать фильтровалкой жидкость вокруг срезов, нанести разведенные вторичные антитела, ассоциированные с пероксидазой;
инкубировать при NT 1h во влажной камере;
отмыть 2х5' в TBSTB в 100ml стеклоприемнике.

Окрашивание DAB.

растворить комплект из двух таблеток "Fast DAB" в 5ml H₂O, очистить: либо ЦФ NT, 5', либо фильтровать через 0.45µm фильтр;
нанести на каждое стекло ~200µl раствора Fast DAB;
следить за ходом реакции, сравнивая с контрольным препаратом (без первичных антител);
когда реакция достигнет насыщения, остановить, сполоснув в TBSTB.

Заключение в Tris-glycerol mountant.

~10-15µl tris-glycerol mountant на препарат;
накрыть покровным стеклом, желательно без пузырей;
осторожно, стараясь не сдвинуть стекло, убрать фильтровалкой лишнюю жидкость;
подсушить 5-10’ NT;
аккуратно обвести периметр покровного стекла бесцветным лаком для ногтей;
препараты хранить при NT в темноте.

> Методы > Иммуногистохимия и in situ > Белок на срезах взрослых мух. Иммуноокрашивание срезов имаго (дрозофила).		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
Приготовление препаратов. Иммуноокрашивание. Окрашивание DAB. Заключение в Tris-glycerol mountant. Растворы. TBS Tris-glycerol mountant TBSTB Комментарии. По пунктам.
Приготовление препаратов. приготовить 5-7µm срезы (см. "Фиксация и заливка в парафин (дрозофила)."), перенести кисточкой на предметное стекло в каплю воды; сушить в термостате 37^oС, ON. Иммуноокрашивание. депарафинировать в гистологических стаканах: ксилол (I) => 5' ксилол (II) => 5' ксилол:EtOH (100%) (1:1) => 2' EtOH (100%) (I) => 1' EtOH (100%) (II) => 1' EtOH (96%) => 1' EtOH (70%) (I) => 1' EtOH (70%) (II) => 1' H₂O (mQ) => 1'; накапливать в стеклоприёмнике mQ, >2'; инкубировать 2х 5' в TBS в 100ml стеклоприемнике; 15' в TBSTB в 100ml стеклоприемнике; приготовить разведение первичных антител в TBSTB из расчета 100-150µl на стекло; убрать фильтровалкой жидкость вокруг срезов (осторожно!) и нанести разведенные первичные антитела (~100-150µl на стекло); инкубировать при NT 2h во влажной камере; отмыть 2х10' в TBSTB в 100ml стеклоприемнике; приготовить разведения вторичных антител из расчета 100-150µl на стекло.; убрать фильтровалкой жидкость вокруг срезов, нанести разведенные вторичные антитела, ассоциированные с пероксидазой; инкубировать при NT 1h во влажной камере; отмыть 2х5' в TBSTB в 100ml стеклоприемнике. Окрашивание DAB. растворить комплект из двух таблеток "Fast DAB" в 5ml H₂O, очистить: либо ЦФ NT, 5', либо фильтровать через 0.45µm фильтр; нанести на каждое стекло ~200µl раствора Fast DAB; следить за ходом реакции, сравнивая с контрольным препаратом (без первичных антител); когда реакция достигнет насыщения, остановить, сполоснув в TBSTB. Заключение в Tris-glycerol mountant. ~10-15µl tris-glycerol mountant на препарат; накрыть покровным стеклом, желательно без пузырей; осторожно, стараясь не сдвинуть стекло, убрать фильтровалкой лишнюю жидкость; подсушить 5-10’ NT; аккуратно обвести периметр покровного стекла бесцветным лаком для ногтей; препараты хранить при NT в темноте.