Приготовление препаратов политенных хромосом.

1. посадить родителей (~20 мух на пробирку с кормом), ~1 сутки при 25^oС;
2. сбросить родителей, выращивать личинки при 16^oС с I до III возраста (~7-8 дней);
3. приготовить предметные стекла:
1. - одно для всех препаратов - для вырезания слюнных желез ;
2. - одно для всех препаратов - для фиксации в растворе II;
3. - для каждого препарата свое - для фиксации в растворе III, расправления хромосом;
4. вырезать слюнные железы в капле (~20-30µl) раствора I, удалить жировое тело;
5. перенести в каплю (~20-30µl) раствора II на 10-30'' (слегка подвигать железы); убрать остатки жирового тела;
6. фиксировать в капле раствора III (20-30µl) 2';
7. накрыть покровным стеклом и вращательным движением расправить хромосомы;
8. фильтровалкой убрать избыток жидкости;
9. поместить стекло в камеру с жидким азотом, ~20';
10. сколоть покровное стекло лезвием.

Иммуноокрашивание.

все дальнейшие отмывки проводить в 100ml стеклоприемниках.

11. отмыть 2х10' в TBS (покачивая);
12. накапливать препараты в стеклоприемнике с TBS при +4^oС;
13. инкубировать 30' в TBSTB;
14. приготовить разведения первичных а/т в TBSTB из расчета ~70-100µl на стекло;
15. нанести каплю с первичными а/т на препарат;
16. не накрывая покровным стеклом, инкубировать при NT 2h во влажной камере (фильтровалка смочена водой);
17. 3х по 5' отмыть в TBSTB (если препаратов мало, использовать 50ml стаканчики);
18. инкубировать с разведенными вторичными а/т (для FITC 1:25; для Cy3 1:300-500 в TBSTB) NT, 1h во влажной камере;
19. отмывать 3х5' в TBSTB;

Заключение в Tris-glycerol mountant.

1. ~10-15µl tris-glycerol mountant на препарат;
2. накрыть покровным стеклом, желательно без пузырей;
3. осторожно, стараясь не сдвинуть стекло, убрать фильтровалкой лишнюю жидкость;
4. подсушить 5-10' NT;
5. аккуратно обвести периметр покровного стекла бесцветным лаком для ногтей;
6. препараты хранить при NT в темноте.