Random primer на polyA+RNA | Практическая молекулярная биология

Комментарии.

Общие.

Чувствительность complex hybridization практически одинакова при использовании Р³²и Р³³(мембрана в обоих случаях завернута в Saran Wrap).

По пунктам.

п. 1.

Если мечение проходит с oligo dT праймера, то вместо (dN)₆ нужно взять (dT)₆ из расчета ~0.7µg на 1.5µg polyA⁺RNA.

п. 13.

Вначале просчитать колонку вместе с элюатом, а затем убрать колонку и просчитать только элюат. Это очень быстрый, но не слишком точный (скорее качественный) метод.

п. 14.

Очень важно, чтобы мембрана постоянно оставалась влажной начиная с п.14.
Сравнивать гибридизационные картинки можно только на мембранах из одного и того же лота.

п. 15.

Для гибридизации можно использовать тот же буфер, что использовался для предгибридизации, если мембрана новая. Если мембрана была отшпарена, она попадает в гибридизационный стакан влажной и может как-то (неконтролируемо) разбавить гибридизационный буфер. В этом случае мы предпочитаем менять предгибридизационный буфер на новый.
Очень важно не слишком экономить на объёме буфера (и внимательно следить, чтобы под мембрану не попали пузыри воздуха), так как иначе на фильтре будут заметны пятна ослабленной гибридизации.

п. 16.

п. 17.

Для горячей отмывки (II) мало поместить стакан с мембраной в горячий гибридайзер. Раствор для отмывки нужно заранее довести до 68⁰C и заливать в стакан уже горячим (лучше заливать в два приёма – первой порцией сполоснуть гибридизационный стакан от старого буфера и одновременно подогреть его, а второй порцией отмывать мембрану указанное время).