Выделение ядерного экстракта из мух. | Практическая молекулярная биология

Растереть 1g мух в жидком азоте, перенести во флакон, содержащий 5ml буфера А, смешать пипеткой до однородной суспензии;
Перенести суспензию в стеклянный гомогенизатор, гомогенизировать (10-15 пассажей) на льду;
Осторожно, по стенке, наслоить суспензию на сахарозный буфер. Соотношение буфер:суспензия=3:1. Центрифугировать 1600g, 5', 4^oC;
Супернатант слить, интерфазу и ядра растворить в 3ml буфера А, смешать пипеткой до однородной суспензии;
повторить п.3;
Супернатант слить, ядра суспендировать в 3ml буфера А, пропустить через Merocloth, центрифугировать 1600g, 5', 4^oC;
Супернатант слить, ядра (неплотный осадок) ресуспендировать в 3ml NU-2;
Центрифугировать 12 krpm, 10', 4^oC;
Супернатант слить, осадок ресуспендировать в 3ml NU-2, гомогенизировать в Даунс гомогенизаторе, перенести в ультрацентрифужную пробирку;
Добавить 1/10V 4М NH₄SO₄. Перемешивать 20' на ротаторе, 4^oC;
Центифугировать 35krpm (Beckman Ti-55), 4^oC, 1h;
Добавить к супернатанту 0.3g/ml растертого NH₄SO₄. 10' на мешалке;
Центрифугировать 12 krpm, 30', 4^oC;
Осадок ресуспендировать в 500µl HEMG-40;
Диализовать 40' против 100ml HEMG-40;
Центрифугировать в эппендорфах на максимальной скорости (14krpm) в центрифуге с охлаждением;
Супернатант заморозить в жидком азоте и хранить на -70^oС.

> Методы > Работа с D. melanogaster > Выделение ядерного экстракта из мух. Выделение ядерного экстракта из мух.		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
Растворы. Буфер А Сток 2x Буфер А Сахарозный буфер NU-2 HEMG-40 Комментарии. Общие. По пунктам.	Лариса Мельникова, Павел Марданов, Дарья Копытова, Институт биологии гена РАН; Несложный метод для получения ядерного белкового экстракта из взрослых мух. Полученный экстракт можно использовать для вестернов, иммунопреципитаций и.т.д.
Растереть 1g мух в жидком азоте, перенести во флакон, содержащий 5ml буфера А, смешать пипеткой до однородной суспензии; Перенести суспензию в стеклянный гомогенизатор, гомогенизировать (10-15 пассажей) на льду; Осторожно, по стенке, наслоить суспензию на сахарозный буфер. Соотношение буфер:суспензия=3:1. Центрифугировать 1600g, 5', 4^oC; Супернатант слить, интерфазу и ядра растворить в 3ml буфера А, смешать пипеткой до однородной суспензии; повторить п.3; Супернатант слить, ядра суспендировать в 3ml буфера А, пропустить через Merocloth, центрифугировать 1600g, 5', 4^oC; Супернатант слить, ядра (неплотный осадок) ресуспендировать в 3ml NU-2; Центрифугировать 12 krpm, 10', 4^oC; Супернатант слить, осадок ресуспендировать в 3ml NU-2, гомогенизировать в Даунс гомогенизаторе, перенести в ультрацентрифужную пробирку; Добавить 1/10V 4М NH₄SO₄. Перемешивать 20' на ротаторе, 4^oC; Центифугировать 35krpm (Beckman Ti-55), 4^oC, 1h; Добавить к супернатанту 0.3g/ml растертого NH₄SO₄. 10' на мешалке; Центрифугировать 12 krpm, 30', 4^oC; Осадок ресуспендировать в 500µl HEMG-40; Диализовать 40' против 100ml HEMG-40; Центрифугировать в эппендорфах на максимальной скорости (14krpm) в центрифуге с охлаждением; Супернатант заморозить в жидком азоте и хранить на -70^oС.