Приготовление растворов.

Приготовление растворов.

• Очень аккуратно работайте с реактивами и стоковыми растворами. Та работа, которую вы выполняете в данный момент не последняя в вашей жизни и в жизни ваших коллег. Поверьте – следующие проекты будут важнее.
• Никогда не трогайте без спроса чужие реактивы (как и вообще - чужие вещи), а по возможности, вообще не пользуйтесь чужими реактивами.
• Если приходится использовать чужой (общественный) реактив или раствор, немедленно возвращайте сток владельцу отсыпав (отлив) небольшую аликвоту.
• Никому не позволяйте трогать собственные реактивы. Отливайте и отсыпайте сами, лень в этом вопросе может обойтись очень дорого.
• Готовьте буферные растворы лишь с небольшим избытком. Растворы гораздо менее стабильны, чем составляющие их компоненты. Вы рискуете получить через месяц раствор, который нельзя использовать. Особенно опасно готовить большие объемы буферов для новых методик. Возможно, что вы будете в конце концов использовать какую-нибудь модификацию метода, для которой приготовленный запас буфера вообще не подходит.
• Удобнее планировать работу так, чтобы готовить сразу несколько наименований реактивов. При этом удобнее готовить растворы в порядке возрастания сложности:

* растворы, не требующие доведения pH;
* растворы, требующие доведения pH;
* "опасные" растворы (все остальные готовые растворы убрать и только потом готовить среды, SDS и т.п.).

Взвешивание.

• В лаборатории есть два типа весов (оба типа позволяют произвольно устанавливать "0" отсчёта):
1. с точностью 0.0001g и пределом измерения до 60g. Они используются для взвешивания:

* небольших количеств веществ (обычно до 100mg, но иногда, когда требуется необычно высокая точность, и больше);
* уравновешивания бакетов для ультрацентрифуги Optima.

2. с точностью 0.01g и пределом измерения до 2kg. Наиболее часто используемые, используются для всех остальных взвешиваний, в том числе для уравновешивания центрифужных пробирок. Расположенная сверху полоса "%" показывает какую часть от максимально допустимого составляет вес на чашке.
• Взвешивание "x"g реактива:
1. установить на весы "пустую" ёмкость;
2. установить "0";
3. насыпать реактива до "x"g.
• Реактив "слежался":

* закрыть банку, как следует потрясти;
* раздробить, используя шпатель (вымытый и прокалённый);
* раздробить, используя стерильную пипетку;

• У банки горловина широкая, а пересыпать нужно в банку с узкой: можно вместо шпателя использовать новый синий тип, одетый на авторучку/карандаш (но не на автоматическую пипетку).
• Легко "летучие" реактивы (такие как бактериальные среды, SDS) взвешиваются только под тягой.
• Очень аккуратно (под тягой, с предосторожностями, чтобы не загрязнить "окружающую среду") взвешиваются:

а) RNase;
б) DNase;
в) Proteinases;
г) Бактериальные среды;
д) SDS и другие летучие детергенты.

• Если при взвешивании реактив попал на весы:

Ни в коем случае НЕ СДУВАТЬ!!! - это способ превратить маленькие неприятности в большие. Нужно аккуратно снять чашку (и, если надо, верхний кожух весов); кожух вымыть и насухо протереть; весы протереть влажной тряпкой/салфеткой, насухо вытереть; всё собрать.

Расчёт растворов.

Существует множество способов измерения концентрации и количества веществ. Тем, кто работает в молекулярной биологии необходимо свободно обращаться по крайней мере с двумя типами единиц: "молями" и "процентами" (тем, кто в коммерции - достаточно "процентов").

Моль.

Моль - единица измерения количества вещества. 1 моль - такое количество вещества в котором содержится 6.022х10²³ (число Авогадро) молекул этого вещества. Моль - единица безразмерная (что-то типа "штук", "дюжин", "сотен").

Однако, когда пишут "M" обычно имеют в виду не количество, а концентрацию: моль/литр. Эта единица измерения имеет размерность [1/L].

Когда имеют в виду действительно количество почему-то пишут "mol" (безразмерная величина). Вполне можно написать, что M=mol/L.

Реально пользоваться этой единицей измерения можно лишь зная "молекулярный вес вещества" - вес 1 моля (6.03х10²³молекул). Обозначается этот вес "Mr", "Mw", и измеряется в граммах.

Молекулярный вес можно найти:

1. непосредственно на банке с реактивом (не лучший способ);
2. в справочнике типа "Merck index" (пожалуй, наиболее грамотный способ);
3. в каталогах таких фирм как Sigma, Merck, Fluka, ICN, Aldrich (наиболее распространённый способ);
4. рассчитать по молекулярной формуле (изредка приходиться поступать и таким образом).

Пример расчёта раствора:

Mg²⁺ 2M, (хранить при NT):

Конц. Сток 200ml MgCl2x6H2O 1M 203.3g/M 40.66g MgSO4x7H2O 1M 246.48g/M 49.30g H2O   mQ 144.6g

p=1.173g/ml.
m(MgCl₂x6H₂O)=1[mol/L]x203.3[g/mol]x0.2[L]=40.66[g]
m(MgSO₄x7H₂O)=1[mol/L]x246.48[g/mol]x0.2[L]=49.30[g]
H₂O - ?*
__________________________________________
* Вычислить, сколько потребуется добавить воды так же просто (в одно действие) не получится. При первом приготовлении придётся использовать градуированную посуду. Вначале растворить соли в заведомо меньшем, чем нужно, количестве воды и лишь затем довести объём до 200ml. Однако, если вы не поленитесь измерить, сколько всего воды потребовалось ({вес колбы с готовым раствором} – {вес колбы с солями до добавления воды}), то в следующий раз вы сможете сразу добавить воды столько, сколько нужно. У нас принято выражать полученный результат в виде плотности раствора p[g/ml]. В вышеприведённом примере:

p[g/ml]=(40.66[g]+49.30[g]+144.6[g])/200[ml]=1.173[g/ml]

Если плотность раствора известна, то нужное количество воды определяется:

m(H₂O)[g]=V_{раствора[}ml]*p[g/ml] - m_{всех остальных компонентов[}g]

Остаётся добавить, что плотность можно определить и непосредственно - взвесив известный объём раствора. Но при этом нужно иметь в виду, что точность измерения объёмов обычно очень невелика и для таких фокусов лучше использовать "мерную колбу" (штука с тонким и длинным горлом и всего одной отметкой на нём); хуже – мерный цилиндр; и уж совсем плохо - стакан.

Процентное содержание.

Процентное содержание - отношение количества данного вещества к количеству всего раствора, выраженное в процентах. В зависимости от того, что понимается под количеством, процентное содержание будет "массовым" (w/w - weight/weight), "объёмным" (v/v - volume/volume) или "смешанным" (например w/v - weight/volume). Первые две единицы измерения безразмерные, и поэтому проблем обычно не вызывают; третья - размерная величина. Весьма печально, но часто не указывается явно какой именно процент имеется в виду (тогда остаётся только догадываться, чаще всего (хотя и не обязательно) подразумевается [g/ml]).

Пример расчёта раствора:
Раствор Денхарда 50х:

Конц. 100ml Ficoll 1% 1.0g Polyvinilpyrolidone 1% 1.0g BSA 1% 1.0g

m(Ficoll)= 100[ml]x1[%g/ml]/100[%]=1[g]

Мы не указали "вид" процентов специально, чтобы проиллюстрировать, как "догадываются". Ficoll, Polyvinilpyrolidone, BSA - твёрдые вещества, так что вряд ли здесь имелся в виду объёмный процент; в то же время конечный раствор - жидкость, так что скорее всего имеется в виду [w/v].

Какую информацию можно найти на банке с реактивом.

1. Название и молекулярная формула;
2. Каталожный номер и название фирмы;
3. Номер партии (lot number);
4. Дата, до которой продукт годен к употреблению;
5. Условия хранения.

Первые три позиции вы обнаружите практически всегда, последние две - лишь у части реактивов.

Наиболее полезная информация содержится в (1) и (2). Если Вы отсыпаете аликвоту какого либо реактива нужно переписывать данные из этих двух пунктов. Зачем нужно переписывать (1) понятно каждому. Данные (2) (каталожный номер и название фирмы) позволяют найти описание реактива в каталоге фирмы, а именно там содержится информация о качестве и свойствах реактива. Эта информация является очень важной; достаточно сказать, что различные реактивы с одинаковыми названиями/формулой часто имеют цены, различающиеся в 5-10 раз.

Способы дополнительной очистки растворов.

Фильтрация.

(а если используется 0.22 µm фильтр, то заодно и стерилизация).

В зависимости от объёма используются различные фильтры:

до 1ml Spin filter units (фильтрация в центрифуге) 1-100ml Шприц - одноразовый фильтр (объём шприца выбирается в зависимости от объёма раствора). 20-50ml 50ml фильтровальная ячейка. 50-200ml 150ml фильтровальная ячейка (можно в несколько приёмов). 150-500ml 250ml фильтровальная ячейка (можно в несколько приёмов). >1l Перистальтический насос - фильтр с заменяемой мембраной.

• Не стоит пытаться профильтровать через субмикронный фильтр заметно грязный раствор - фильтр забьется. В таких случаях необходимо либо проводить предварительную фильтрацию через фильтр из стекловолокна (GFA, GFB, GF/C, GF/D и GF/F) или ватман 3MM, либо устанавливать префильтр:

* для работы со шприцом - отдельная ячейка очень похожая на обычный фильтр,
* для фильтрующих ячеек - кружочки GFC или 3MM положенные на мембрану.

• Для особо чувствительных применений перед фильтрацией имеет смысл промыть мембрану mQ (просто профильтровать через ячейку немного воды и сбросить её).
• Пара слов о допустимости фильтрования. Нужно иметь в виду два ограничения:
1. Материал мембраны и самой фильтрующей ячейки не должен взаимодействовать/растворяться в фильтруемом растворе (обычно это ограничение не является проблемой, если раствор не содержит органических растворителей или сильных кислот/щелочей). Разобраться с устойчивостью обычно удаётся с помощью каталога фирмы-производителя фильтра.
2. Компоненты вашего раствора не должны адсорбироваться на мембране (особенно любят это делать белки и нуклеиновые кислоты). Особое внимание в двух часто встречающихся случаях: при использовании GFC-фильтра и при выборе фильтра для очистки образца перед гель-фильтрационной колонкой.
• Стерилизующей фильтровальной ячейкой можно пользоваться несколько раз, если стерилизуется

* один и тот же раствор;
* растворы различаются лишь pH;
* "вторым", стерилизуется раствор, содержащий все компоненты, из которых состоит предыдущий.

В промежутке можно сполоснуть ячейку, профильтровав небольшое количество mQ.

• Хранение.

Нужно иметь в виду, что если вы заинтересованы именно в "стерилизации", то долго хранить использованный фильтр, видимо, нельзя (можно в течении нескольких часов профильтровать несколько растворов, но потом - выбросить). Однако, если нужна "очистка", то можно (и нужно):

1. сполоснуть приёмную часть mQ/дистиллятом;
2. профильтровать ~100ml mQ/дистиллята;
3. выбросить профильтрованную жидкость, предварительно ополоснув ей банку;
4. повторить пп. 2, 3;
5. стряхнуть, просушить, хранить собранным при NT.

Очистка углём.

Видимо она уходит в прошлое вместе с советскими реактивами. Способ очистки:

1. насыпать ~чайную ложку угля на литр раствора;
2. смешивать на магнитной мешалке 2h-ON;
3. фильтровать через ватман 3ММ;
4. фильтровать через субмикронный фильтр.

Главное ограничение - нужно быть уверенным, что уголь не адсорбирует нужные вам компоненты раствора.

Деионизация.

Только для неионных растворов. Обычно (если уж потребовалась деионизация) получающийся раствор нестабилен, поэтому деионизируйте понемногу и непосредственно перед применением, храните то, что получилось в соответствующих условиях (небольшие аликвоты; охлаждение +4^oС, -20^oС или -70^oС; "темнота" и тому подобное).

Автоклавирование.

Стерилизация фильтрованием описана выше. Другой обычный способ стерилизации - автоклавирование. Ограничение - все компоненты раствора должны выдерживать нагрев.

Правила:

• Банка должна быть заполнена не более чем на 3/4 (видимо, при автоклавировании раствор иногда закипает и нужно, чтобы он при этом не выплёскивался).
• Банка должна быть закрыта НЕПЛОТНО (иначе может взорваться).
• Должна быть приклеена автоклавная ленточка.
• Сразу после автоклавирования агара его нужно смешать, иначе он застынет как неоднородная субстанция: внизу существенно более концентрированная, чем вверху.
• Стерилизация пластика. После автоклавирования нужно сразу же достать банки/коробки с типами/эппендорфами (пока они ещё горячие) и поместить их открытыми под ламинар для просушки (можно/лучше под UV).
• Важно отдавать себе отчёт в том, что автоклав - это реальный прибор, внутри которого есть своя грязь, а пар изнутри автоклава наверняка проникает в неплотно закрытую банку. Нужно соотносить это загрязнение с выгодой от автоклавирования прежде чем решить, стоит автоклавировать раствор или нет.
  Мы стерилизуем лишь тот пластик, который используется для стерильной работы с бактериями (для культур клеток используется покупной стерильный или стерилизация в "специализированном - культуральном" автоклаве). Мы считаем, что для всех остальных работ дополнительная грязь, которая оказывается на пластике после высушивания делает автоклавирование даже вредным.

Очистка спирта.

Можно обойтись без очистки если использовать "фирменный" этанол. Обычный необходимо чистить (для всех применений, исключая стерилизацию поверхностей и фиксацию гелей).

1. на 1L спирта добавить ~0.2g KMnO₄, смешивать на магнитной мешалке ON (в специально отведённой для этого посуде, так как она сильно загрязняется марганцовкой);
2. фильтровать через 3ММ;
3. чистить углём (можно гранулированным, из противогазных баллонов);
4. фильтровать через 3ММ;
5. фильтровать через субмикронный фильтр (на перистальтическом насосе);
6. перегнать;
7. хранить в плотно закрытой и замотанной парафильмом посуде (чтобы спирт не адсорбировал воду из воздуха).

Лабораторный пластик.

Сорта пластика, используемого в лаборатории.

• Полипропилен (обычное сокращение в литературе: PP).
  Из него изготовлены типы, практически всегда - 0.2-2.0ml микроцентрифужные пробирки, обычно 15ml и 50ml центрифужные пробирки. Он выдерживает практически все вещества, которые встречаются в лабораторной практике.
• Полистирен.
  Бактериальные чашки Петри, культуральный пластик, пластиковые пипетки. Довольно часто 15ml и 50ml центрифужные пробирки. Он не выдерживает фенол, хлороформ, DMSO, DMFA.
• Полиэтилен.
  Редко, но встречаются типы и микроцентрифужные пробирки. Пробирки рвутся при центрифугировании в настольной микроцентрифуге, лучше ими вообще не пользоваться.
• Ультрацентрифужные пробирки. Гораздо более подробную информацию можно найти в каталоге Beckman.
  • Ultra-Clare тонкостенные и быстрозапаивающиеся пробирки. Только холодная стерилизация, нельзя использовать спирт. Плохо переносят щелочные растворы (>pH 8). Плохо переносят DMSO и большинство органических растворителей (в т.ч. все спирты).
  • Полиаломерные тонкостенные и быстрозапаивающиеся пробирки, толстостенные пробирки и банки. Можно автоклавировать при 121^оС. Выдерживают большинство кислот, многие основания, многие спирты, DMSO и некоторые органические растворители.
  • Поликарбонатные толстостенные пробирки и банки. Можно (хотя лучше этого не делать) автоклавировать при 121^оС. Холодная стерилизация, но не спиртом. Плохо переносят щелочные растворы (>pH 8). Выдерживают некоторые слабые кислоты. Плохо переносят щёлочи, спирты и большинство органических растворителей.
  • Cellilose propionate пробирки. Холодная стерилизация, но не спиртом. Плохо переносят большинство кислот, щёлочей, спирты и большинство органических растворителей.
  • Полипропиленовые пробирки и банки. Можно автоклавировать при 121^оС. Выдерживают большинство кислот, щелочей и спиртов. Плохо переносят большинство органических растворителей.
  • Пробирки из нержавеющей стали. Можно автоклавировать (но после - высушить). Выдерживают большинство органических растворителей. Плохо переносят большинство кислот и щелочей.
  • Полиэтиленовые пробирки. Можно автоклавировать при 121^оС. Плохо переносят органические растворители, спокойно - сильные кислоты и щёлочи.
  • Corex/Pyrex пробирки и банки. Можно автоклавировать при 121^оС. Выдерживают большинство кислот и щелочей.

Типы.

Мы имеем три типа жёлтых (<200 µl) типов:

с "толстым" кончиком;
с "заострённым" кончиком;
с фильтром.

Первый тип - самый дешёвый, по возможности, лучше использовать его.

Второй - более удобный и точный (при работе с небольшими (<5 µl) объёмами). Эти типы используются:

а) при отборе объёмов <2 µl (в том числе практически вся работа с ферментами),
б) для работы с дорогостоящими растворами (RNA, нуклеотиды, олигонуклеотиды, пептиды). В этом случае более высокое качество гарантирует, что раствор не останется на внешней и внутренней поверхностях типа.

Третий тип - только для очень тонких работ (очень чувствительные к загрязнениям PCR-реакции, сложные ферментативные реакции). Начинающим их использование не грозит.

Синие типы - двух типов, с фильтром и без. Применение - аналогично жёлтым.

H₂O.

В лаборатории имеется вода трёх сортов:

* водопроводная для заваривания чая; мытья рук, лабораторной посуды, форезных камер.
* дистиллированная для ополаскивания лабораторной посуды, форезных камер, приготовления бактериальных сред.
* mQ для приготовление всех остальных растворов и буферов.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru