Многокомпонентные растворы.

Инструкция по работе с прописями растворов откроется в новом окне при нажатии на эту кнопку:

TE

1x; pH7.4; 7.6; 8.0; (хранить при 4^oС).

Конц. Сток 1ml 5ml 10ml 50ml 400ml Tris Cl 10mM 1M 10µl 50µl 100µl 500µl 4ml EDTA 1mM 0.5M 2µl 10µl 20µl 100µl 800µl H2O   mQ 988µl 4.94ml 9.88ml 49.4ml 395ml

10x:

Конц. Сток 1ml 5ml Tris Cl 0.1M 1M 0.1ml 0.5ml EDTA 10mM 0.5M 20µl 0.1ml H2O mQ   880µl 4.4ml

Стерилизовать автоклавированием.

STE

1x; (хранить при 4^oС).

Конц. Сток 1ml 5ml 10ml 50ml NaCl 0.1M 5M 20µl 100µl 200µl 1.0ml Tris Cl, pH8.0 10mM 1M 10µl 50µl 100µl 0.5ml EDTA, pH8.0 1mM 0.5M 2µl 10µl 20µl 100µl H2O   mQ 0.968ml 4.84ml 9.68ml 48.4ml

10x:

Конц. Сток 1ml 5ml NaCl 1.0M 5M 0.2ml 1.0ml Tris Cl 0.1M 1M 0.1ml 0.5ml EDTA 10mM 0.5mM 20µl 0.1ml H2O mQ   680µl 3.4ml

Стерилизовать автоклавированием.

SSC

20x; pH 7.0; (хранить при NT).

Конц. Сток 0.5L 1.5L 2L NaCl 3M 58.44g/M 87.66g 263.0g 350.6g Na3C6H5O7x 5.5H2O 0.3M 357.1g/M 53.57g 160.7g 214.3g H2O   mQ 440.3ml 1.32L 1.76L

p =1.103

TAE

1x pH=7.6:

Tris-acetate 40mM
EDTA 1mM

(хранить основной сток при 4^oС, рабочее количество (~100ml) при NT)

Конц. Сток 100ml 150ml 200ml 250ml Tris-base 2M 121.1g/M 24.22g 36.33g 48.44g 60.55g EDTA 0.05M 372.3g/M 1.862g 2.792g 3.723g 4.654g Укс. к-та ~1.56M 17.4M ~8.96ml ~9.40g ~13.44ml ~14.10g ~17.92ml ~18.80g ~22.40ml ~23.50g ~ ~ H2O   mQ ~73.30g ~109.95g ~146.60g ~183.25g ~

p(50x)=1.0878

Удобно вначале растворить Tris и EDTA и лишь затем добавлять кислоту, следя за pH.

TBE

10x, pH ~8.3;(хранить при NT в чистой посуде)

1x 10x Сток 1L Tris base 89mM 0.89M 121.14g/M 107.8g Boric acid 89mM 0.89M 61.83g/M 55.03g EDTA, pH 8.0 2mM 20mM 500mM 40ml 43.84g H2O     mQ 863.3ml

10х сток вполне устойчиво хранится при NT, если его профильтровать через 0.4µm фильтр.

Для PAAG используется как 1х, для агарозных - как 0.5х.

Для агарозных гелей имеет смысл применять при работе с маленькими (< 200bp) фрагментами. Считается, что клонирование из ТВЕ гелей сложнее, чем из ТАЕ.

FGRB

50x (formaldehyde gel-running buffer), p=1.104g/ml (хранить при +4^oС):

Конц. Сток 0.5L 1.0L 2.0L MOPS (pH7.0) 1.0M 209.27g/M 104.64g 209.27g 418.54g AcONax3H2O 0.5M 136.08g/M 34.02g 68.04g 136.08g EDTAx2H2O 50mM 372.3g/M 9.31g 18.62g 37.23g H2O   mQ 404.0ml 808ml 1616ml

Конц. Сток 0.5L 1.0L 2.0L MOPS (pH7.0) 1.0M 209.27g/M 104.64g 209.27g 418.54g AcONa anhydrous 0.5M 82.04g/M 20.51g 41.02g 82.04g EDTA x 2H2O 50mM 372.3g/M 9.31g 18.62g 37.23g H2O   mQ 417.5ml 835ml 1670ml

Довести до pH7.0 10N NaOH (на 500ml буфера ~22ml), фильтровать через 0.22µm фильтр.

На свету (в процессе хранения) желтеет, но это не сказывается на его качестве.

GTGB

20x /Glycerol tolerant gel buffer/ (хранить при +4^oС):

Конц. Сток 1L 1.5L 2.0L 2.5L Tris base 1.78M 121.14g/M 216g 324g 432g 540g Taurine 0.56M 125.15g/M 72g 108g 144g 180g Na2EDTAx2H2O 10.7mM 372.3 g/M 4g 6g 8g 10g H2O   mQ 802ml 1203ml 1604ml 2005ml

p=1.094

Taurine: C₂H₇NO₃S; Mw=125.15g/M.

TGB

Tris-Glycine buffer 5x, pH8.3, (хранить основной сток при +4^oС, рабочий сток - при NT).

1x Конц. Сток 1L 1.5L Tris-base 25mM 125mM 121.1g/M 15.1g 22.71g Glycine 250mM 1.25M 75.05g/M 94g 141g SDS 0.1% 0.5% 10% 50ml 75ml H2O     mQ

Буфер для внесения

10х, (хранить при NT).

Конц. Сток 1ml 5ml 10ml 25ml ксилен-цианол 0.1% тв. 1.0mg 5.0mg 10mg 25.0mg бромф. синий 0.1% тв. 1.0mg 5.0mg 10mg 25.0mg SDS 0.5% 10% 50µl 250µl 500µl 1.25ml EDTA, pH8.0 0.1M 0.5M 0.2ml 1.0ml 2.0ml 5.0ml глицерол 50% 100% 0.5ml 0.625g 2.5ml 3.125g 5.0ml 6.25g 12.5ml 15.63g H2O   mQ 0.25ml 1.25ml 2.5ml 6.25ml

PEG-NaCl

(хранить при 4^oC).

Конц. Сток 50ml 100ml 150ml 200ml NaCl 1.6M 58.44g/M 4.675g 9.35g 14.03g 18.70g PEG-6000 13% тв. 6.50g 13.00g 19.50g 26.00g

или:

Конц. Сток 50ml 100ml 150ml 200ml NaCl 1.6M 5M 16ml 18.97g 32ml 37.95g 48ml 56.92g 64ml 75.90g PEG-6000 13% 40% 16.25ml 32.50ml 48.75ml 65.00ml

SM

(хранить при 4^oC).

Конц. Сток 10ml 50ml 100ml 150ml NaCl 0.1M 5M 200µl 1.0ml 2.0ml 3.0ml MgSO4* 10mM 1M 100µl 0.5ml 1.0ml 1.5ml Tris Cl, pH7.5 50mM 1M 0.5ml 2.5ml 5.0ml 7.5ml желатин 0.01% 2% 50µl 0.25ml 0.5ml 0.75ml H2O   mQ 9.15ml 45.75ml 91.5ml 137.25ml

* - добавлять после автоклавирования,

Стерилизовать автоклавированием.

STM

(хранить при 4^oС):

Конц. Сток 50ml NaCl 10mM 5M 100µl Tris Cl pH8.0 50mM 1M 2.5ml MgCl2 10mM 1M 500µl H2O   mQ 46.9ml

TM

(хранить при 4^oС):

Конц. Сток 50ml Tris Cl pH8.0 50mM 1M 2.5ml MgCl2 10mM 1M 500µl H2O   mQ 47.0ml

Денатурирующий буфер

(хранить при NT).

Конц. Сток 100ml 150ml 300ml 500ml 750ml NaCl 1.5M 58.44g/M 8.766g 13.15g 26.30g 43.83g 65.75g NaOH 0.5M 10M 5ml 6.65g 7.5ml 9.97g 15ml 19.94g 25ml 33.23g 37.5ml 49.84g     40g/M 2g 3g 6g 10g 15g

Нейтрализующий буфер

(хранить при NT).

Конц. Сток 150ml 300ml 500ml 750ml Tris Cl, pH7.4 1M 121.1g/M 18.15g 36.3g 60.5g 90.75g NaCl 1.5M 58.44g/M 13.15g 26.30g 43.83g 65.75g HCl ~0.81M 11.6M/L ~10.5ml ~21ml ~35ml ~52.5ml EDTA (optional) 1mM 0.5M 0.3ml 0.6ml 1ml 1.5ml

Проявитель Рентген 2

(хранить при NT в темноте).

500ml 800ml 1l метол 1.1g 1.76g 2.2g Na2SO3б/в 36.0g 57.6g 72.0g гидрохинон 4.4g 7.04g 8.8g сода б/в 24.0g 38.4g 48.0g KBr 2.0g 3.2g 4.0g H2O 490ml 784ml 980ml

растворять в указанном порядке, p=1.115.

Фиксаж БКФ 2

(хранить при NT).

500ml 800ml 1l Na2S2O3x 5H2O 130g 208g 260g NH4Cl 25g 40g 50g Na серноватисто-кислый пиро. 8.5g 13.6g 17g H2O 398ml 636.8ml 796ml

растворять в указанном порядке, p=1.123.

Сцинцилляционный раствор

(хранить в темноте при NT):

0.5L 1L PPO 2.50g 5.00g POPOP 0.05g 0.10g Толуол

I плазмидный раствор

(хранить при +4^oС)

Конц. Сток 50ml 100ml 150ml 200ml Глюкоза 50mM 2M 1.25ml 1.41g 2.5ml 2.825g 3.75ml 4.24g 5.0ml 5.56g Tris Cl, pH 8.0 25mM 1.0 M 1.25ml 2.5ml 3.75ml 5.0ml EDTA 10mM 0.5 M 1.0ml 2.0ml 3.0ml 4.0ml H2O   mQ 46.5ml 93ml 139.5ml 186ml

II плазмидный раствор

Конц. Сток 0.5ml 1ml 2.5ml 5.0ml 6.5ml 8.5ml 11ml NaOH 0.2N 1N 0.1ml 0.2ml 0.5ml 1.0ml 1.3ml 1.7ml 2.2ml SDS 1% 10% 0.05ml 0.1ml 0.25ml 0.5ml 0.65ml 0.85ml 1.1ml H2O   mQ 0.350ml 0.7ml 1.75ml 3.5ml 4.55ml 5. 95ml 7.7ml

Смесь для окрашивания олигонуклеотидных гелей

(хранить при NT).

Конц. Сток 100ml 200ml 300ml 500ml AcONa(5.2) 0.5M 3M 17ml 33ml 50.0ml 83ml Met. blue 0.04% 0.2% 20ml 40ml 60ml 100ml H2O   mQ 73ml 127ml 190ml 317ml

Mg²⁺2M

(хранить при NT).

Конц. Сток 200ml MgCl2x6H2O 1M 203.3g/M 40.66g MgSO4x7H2O 1M 246.48g/M 49.30g H2O   mQ 144.6g

p=1.173g/ml.

Деионизация формамида (мочевины, акриламида, глиоксаля).

1. приготовить AG 501-X8 (из расчета 5g на 100ml (но для глиоксаля 1:1 w/w));
2. сполоснуть смолу ~1ml/1g, выбросить раствор;
3. смешивать ~1 час, без света завернув в алюминиевую фольгу;
4. фильтровать (через фильтровальную бумагу);
5. хранить при -20^oС в банке тёмного стекла или завернув в фольгу.

При деионизации формамида смола меняет цвет с голубого на золотистый вне зависимости от насыщения ионообменника.

HSB (f⁺)

high SDS hybridization buffer(хранить основной сток при 4^oС, рабочий - NT)

Конц. Сток 500ml SDS 7% тв. 35g Formamid 50% 100% 250ml 283.3g SSC 5x 20x 125ml 145.3g Bloc. Reagent 2% тв. 10g NaP (pH 7.0) 50mM 1M 25ml 27.6g N-Lauroylsarcosine Na 0.1% 10% 5ml 5.1g Salm.Sperm DNA 50µg/ml 10µg/µl 2.5ml H2O   mQ 49ml

p=1.111

вместо 2% Blocking Reagent ("Roche Diagnostics GmBH; бывший Boehringer Mannheim"
#1 096 176) можно использовать 10x Denhardt или сухое обезжиренное молоко.

Blocking Reagent можно растворить, лишь в буфере с высокой ионной силой (в данном случае - в H₂O+SSC+NaP).

Salmon sperm DNA должна быть раздробленной и денатурированной.

Рестрикционные буфера 10x

А.

Конц. Сток 100µl 1ml Tris Ac (pH7.9 37oC) 33mM 1M 33µl 330µl MgAc 10mM 1M 10µl 100µl KAc 66mM 5M 13.2µl 132µl DTT 0.5mM 1M 0.5µl 5µl H2O   mQ 43.3µl 433µl

B.

Конц. Сток 100µl 1ml Tris Cl (pH 8.0 37oC)) 10mM 1M 10µl 100µl MgCl2 5mM 1M 5µl 50µl NaCl 100mM 5M 20µl 200µl b-Me 1mM 1M 1µl 10µl H2O   mQ 64µl 640µl

L.

Конц. Сток 100µl 1ml Tris Cl (pH 7.5 37oC) 10mM 1M 10µl 100µl MgCl2 10mM 1M 10µl 100µl DTT 1mM 1M 1µl 10µl H2O   mQ 79µl 790µl

M.

Конц. Сток 100µl 1ml Tris Cl (pH7.5 37oC) 10mM 1M 10µl 100µl NaCl 50mM 5M 10µl 100µl MgCl2 10mM 1M 10µl 100µl DTT 1mM 1M 1µl 10µl H2O   mQ 69µl 690µl

H.

Конц. Сток 100µl 1ml Tris Cl (pH7.5 37oC) 50mM 1M 50µl 50µl MgCl2 10mM 1M 10µl 100µl NaCl 100mM 5M 20µl 200µl DTT 1mM 1M 1µl 10µl H20   mQ 19µl 190µl

Раствор Денхарда 50х

(хранить при -20^oС)

Конц. Сток 50ml 300ml 1L Ficoll 400 1%(w/v) тв. 0.5g 3.0g 10g Polyvinilpyrolidone 1%(w/v) тв. 0.5g 3.0g 10g BSA (fr V) 1%(w/v) тв. 0.5g 3.0g 10g H2O   mQ 46.7ml 292.2ml 974ml

p=1.004

фильтровать;

можно готовить как 100х.

PBS (рецепт 1)

pH(1x)=7.4, (хранить при NT или при 4^oС):

1x Конц. Сток 100ml 500ml KH2PO4 1.7mM 17mM 136.1g/M 0.231g 1.157g Na2HPO4 5.2mM 52mM 142g/M 0.738g 3.692g NaCl 150mM 1.5M 58.44g/M 8.77g 43.83g H2O   mQ

1x Конц. Сток 100ml 500ml KH2PO4 1.7mM 17mM 136.1g/M 0.231g 1.157g Na2HPO4x7H2O 5.2mM 52mM 268.1g/M 1.394g 6.971g NaCl 150mM 1.5M 58.44g/M 8.77g 43.83g H2O   mQ

PBS (рецепт 2) 10x

pH(1x)=7.3, (хранить при NT или при 4^оС)

1x 10x Сток 100ml 500ml KH2PO4 1.47mM 14.7mM 136.1g/M 0.2g 1.0g Na2HPO4x7H2O 4.29mM 42.9mM 268.1g/M 1.15g 5.75g NaCl 137mM 1.37M 58.44g/M 8.0g 40.0g KCl 2.68mM 26.8mM 74.56g/M 0.2g 1.0g H2O     mQ

PBS (рецепт 3) 10x

pH(1x)=7.3, (хранить при NT или при 4^оС)

1x 10x Сток 100ml 500ml KH2PO4 2mM 20mM 136.1g/M 0.272g 1.36g Na2HPO4x7H2O 10mM 100mM 268.1g/M 2.68g 13.41g NaCl 137mM 1.37M 58.44g/M 8.0g 40.0g KCl 2.7mM 27mM 74.56g/M 0.20g 1.01g H2O     mQ

стерилизовать автоклавированием;

pH зависит от концентрации, поэтому измерять лишь разбавив до 1х.

pH 10x должен быть ~6.8 (если необходимо, можно довести NaOH). Стерилизовать автоклавированием. После разбавления pH должен стать 7.4.

SSPE

pH 7.4

Конц. Сток 1L NaCl 3M 58.44g/M 175g NaH2PO4xH2O 200mM 137.99g/M 27.6g EDTA 20mM 372.24g/M 7.4g

Доводить pH 10N NaOH.

RNase A (DNase free)

(хранить при -20^oС, рабочую аликвоту можно при 4^oС)

1. растворить 10mg/ml в 1-50mM AcONa (pH4.5);
2. кипятить 15', дать медленно остыть до комнатной температуры;
3. хранить рабочий (маленький, ~50 µl) сток при +4^oС, основное количество - в аликвотах по ~0.5ml на -20^oС.

Буфер для хранения RNAse

(хранить при -20^oC).

Конц. Сток 1ml 5ml 10ml Tris Cl, pH7.6 10mM 1M 10µl 50µl 100µl глицерин 50% 100% 0.5ml 0.630g 2.5ml 3.152g 5.0ml 6.305g H2O   mQ 0.486g 2.43g 4.86g

Proteinase K

(хранить при +4^oС, долговременное хранение при –20^oС):
20mg/ml раствор в 10mM Tris Cl, 1.0mM CaCl₂, 30% glycerol.

EDTA/glycogen

20х (хранить при -20^oС):

Конц. Сток 1.0ml EDTA 0.2M 0.5M 400 µl glycogen 1mg/ml 20mg/ml 50 µl H2O   mQ 550 µl

Буфер для DNase RQ1

10x (хранить при -20^oС):

Конц. Сток 1ml Tris Cl (pH8.025oC) 0.4M 1M 400µl NaCl 0.1M 5M 20µl MgCl2 60mM 1M 60µl CaCl2 0.1M 1M 100µl H20   mQ 420µl

Буфер для хранения DNAse

(хранить при -20^oC).

Конц. Сток 1ml 1.5ml 2.5ml 5ml 10ml Tris Cl, pH 7.0 20mM 1M 20µl 30µl 50µl 100µl 200µl NaCl 50mM 5M 10µl 15µl 25µl 50µl 100µl DTT 1mM 1M 1µl 1.5µl 2.5µl 5.0µl 10µl глицерин 50% 100% 0.5ml 0.630g 0.75ml 0.9g 1.25ml 1.58g 2.5ml 3.15g 5.0ml 6.31g H2O   mQ 0.485g 0.73g 1.21g 2.42g 4.85g

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru