| Стерильный пинцет. Стаканчик со стерильными зубочистками. | | Чашка с бактериями. | | Пробирки с ростовой средой. | | Мусорница. |
|
- Под "грязными" подразумеваются либо нестерильные, либо содержащие живые клетки объекты. В этом смысле матрас с эукариотическими клетками, с которым вы стараетесь работать как можно более аккуратно, тоже надо рассматривать как "грязный".
- Грязь падает сверху, поэтому постарайтесь:
- ничего не проносить над открытыми ёмкостями и перевёрнутыми пробками;
- не оставлять открытыми дольше, чем это необходимо коробки с типами, банки со средами, пробирки, чашки Петри, культуральные матрасы.
- Особенно внимательно относитесь к тем местам инструментов, откуда грязь способна легко проникнуть в среду:
- не прикасайтесь к горлышку рядом с пробкой (удобно использовать крышки из фольги);
- внимательно работайте с алюминиевым пеналом со стерильными пипетками, доставайте из него пипетки только стерильным пинцетом.
- При стерилизации автоклавированием и прокаливанием стоит иметь в виду, что
- когда вы достаёте какую либо ёмкость из автоклава воздух в ней горячий. При остывании он сжимается и подсасывает воздух снаружи. Нужно, чтобы этот воздух был не слишком грязным.
- если прокаливается перевёрнутая влажная колба, то водяные пары остаются внутри (молекулярный вес воды меньше, чем воздуха). Когда колба остынет, пар вновь сконденсируется и колба окажется изнутри влажной.
Что делать, если случился "зарост".
- Заросшая банка или чашка - это разрыв в стерильной работе. Важно не дать ему распространиться. Правила "локализации" проблемы:
- Открывать заросшие ёмкости очень опасно - многие бактериофаги и споры грибов летучи. Нужно не полениться и вылить заросшую среду в туалет и там же сполоснуть банку (если выливать в лабораторную раковину - возможны брызги, а значит - распространение проблемы).
- Нужно иметь очень веские причины для продолжения работы с заросшей чашкой. Но даже если такие причины найдутся лучше сделать эту работу как можно более кратковременной. В ЛЮБОМ СЛУЧАЕ НЕ ПОД ЛАМИНАРОМ.
- При работе с бактериями возможно (у нас ещё никогда не было) появление на чашке очень крупных (0.5-3cm) бляшек бактериофагов. Это не фаг лямбда, и не M13, а очень опасная лабораторная проблема. Такую чашку нельзя открывать ни в коем случае. Её нужно аккуратно поместить в полиэтиленовый пакет и выбросить (даже если чашка стеклянная), причём лучше на улицу, в контейнер.
Работа под ламинаром.
- НЕДОПУСТИМО, чтобы в одном ламинаре проводилась работа с бактериями, дрожжами и клетками высших эукариот. Обычно требуется использовать даже различные комнаты.
- Если в один и тот же день приходится работать и с бактериями и с дрожжами и с клетками высших эукариот, лучше спланировать день так, чтобы порядок работы был:
Высшие эукариоты;
Дрожжи;
Бактерии.
- Порядок работы под ламинаром:
- протереть внутреннюю поверхность раствором детергента (или 70-100% спиртом);
- поместить под ламинар всё, что потребуется для работы за исключением
а) UV-чувствительных компонентов (обычно ваши клетки),
б) мусорницы (она слишком грязная для того, чтобы постоянно болтаться под ламинаром, её лучше ставить лишь тогда, когда она действительно нужна);
- ~5-10' прожечь UV;
- непосредственно работа (вначале сделать всё, что можно без присутствия "грязных" компонентов. Убрать всё ненужное. Внести под ламинар "грязные" компоненты (иногда лучше по очереди);
- по окончании работы вновь протереть ламинар раствором детергента (или 70-100% спиртом), выбросить мусор из мусорницы.
Инструменты и их применение.
Пинцет, платиновая петля, стеклянный шпатель.
Стерилизация:
- обмакнуть в спирт;
- сжечь спирт/прокалить инструмент на пламени горелки*;
- охладить**;
- (не обязательно) перед использованием шпателя или петли неплохо на всякий случай прикоснуться ими к поверхности агара (петля - ~5'', шпатель - ~30''), чтобы быть уверенным, что они не горячие.
________________
* конечно, можно простерилизовать всю петлю - до пластиковой рукоятки. Но нужно иметь в виду, что массивные металлические части (особенно зажим) остывают медленно и часто разумно ограничиться стерилизацией лишь самой петли (однако, в этом случае и засовывать её в пробирку со средой можно лишь на длину проволочки).
** охлаждение металлических инструментов можно ускорить: вновь окунуть раскалённую часть в спирт (но, ВНИМАНИЕ!!!, при этом нужно быть уверенным, что предыдущий спирт действительно выгорел), охладить в нём, а затем быстро пронести над горелкой, лишь бы спирт успел загореться. Спирт сгорит, не успев нагреть инструмент так же сильно, как газовая горелка.
Зубочистки.
- Деревянные зубочистки можно стерилизовать как автоклавированием, так и прокаливанием при 120oС. Для выкалывания бактерий можно использовать оба конца (зубочистку держать за середину).
Стерильный пинцет.
- Очень полезный инструмент. Используется для извлечения стерильных зубочисток из стакана, стерильных пипеток из алюминиевого пенала.
Стеклянные пипетки.
- Существенно более дешёвая альтернатива пластиковым. Главный недостаток - нужно очень внимательно следить за тем, чтобы верхний конец пипетки не имел сколов. Сколы могут очень быстро испортить уплотнители у Pipet pump.
Стеклянные шарики.
- Используются для распределения бактерий по 22х22сm2чашкам. После использования собрать, вымыть детергентом, прополоскать, высушить. Стерилизовать прокаливанием (оптом) или автоклавированием (в полипропиленовых 15ml пробирках порциями по 10-15 шариков).
Кронцанг.
- Незаменим при работе с резиновыми пробками.
UV.
- Очень серьёзный стерилизатор. Даже кратковременное (~10-20'') облучение губительно для клеток.
Пластиковые чашки Петри.
- Любая чашка, с которой Вы работаете, должна быть подписана. Чашки подписываются только снизу (со стороны агара). Причину такого выбора проще всего понять сняв одновременно крышки с двух чашек, подписанных сверху.
- Можно использовать многократно для работы с любыми бактериями. Вымыть, высушить, протереть 70-100% спиртом, поместить открытыми под UV на ~15-30'. Многие (но не все) линии эукариотических клеток так же допускают многократное использование чашек.
Пластиковые крышки для бактериальных пробирок.
- Вымыть, высушить, автоклавировать.
Руки.
- Перед работой помыть, протереть 70% спиртом (100% - сушит кожу). Или одеть перчатки и протирать уже их.
Особенности работы с эукариотическими клетками.
- Лучше пользоваться лабораторным халатом, предназначенным только для клеточного блока.
- Обязательно использовать сменную обувь, а не ту, в которой ходите по улице.
- Нужно выделить определённые пипетки и инструменты и не использовать их ни для чего, кроме культуральных работ.
- Для хранения реактивов и сред использовать либо отдельный холодильник, либо отдельную тумбочку в холодной комнате (их мыть - детергентом, а затем протирать либо спиртом, либо раствором формалина).
- Опасность "заростов" выше в тёплое время года.
Работа с бактериями.
- С бактериями можно чисто работать "на столе" - без ламинара. Всё, что для этого требуется:
- чистое, незахламлённое место (важно вовремя выбрасывать всё, что способно зарасти);
- отсутствие сквозняков или хлопающих поблизости дверей.
- Выкалывание бактериальных колоний. Для заражения достаточно один раз обмакнуть зубочистку вначале в колонию, а потом в среду. Если вы очень дотошный человек - после того как вы обмакнули зубочистку в колонию, размажьте налипшие бактерии по стенке пробирки (их видно), затем наклоните пробирку так, чтобы среда дошла до бактериального пятнышка и, действуя той же зубочисткой как скребком, соскоблите пятно в среду.
- Если предстоит высеять несколько штаммов бактерий с различной устойчивостью к антибиотикам стоит работать с ними по очереди, в порядке возрастания устойчивости (например: вначале высев на среду без антибиотиков, затем только с ампициллином, и в конце - с ампициллин/тетрациклином).
Бактериальные чашки Петри.
Обычно чашка подписывается два раза. Первый раз при заливке:
(1) среда,
(2) антибиотики и другие добавки (обычные сокращения - смотри таблицу),
(3) дата (число и месяц).
Второй раз при высеве бактерий:
(4) название плазмиды или библиотеки,
(5) опять дата.
| среда M9 | M9 | | Хлорамфеникол | Cm, Cam |
| среда LB | LB | | Смесь антибиотиков "GE" | GE |
| среда SOB | SOB | | Ампициллин | A, Amp. |
| среда SOC | SOC | | Tetracycline | T, Tet. |
| среда NZY | NZY | | IPTG | I |
| среда YENB | YENB | | X-Gal | X |
| среда 2YT | 2YT | | Глюкоза | Glu |
| Terrific Broth | TB | | Мальтоза | M |
| | | | Thiamine | Thi |
| | | | Carbenicillin | Cb |
|
- Заливка чашек (на чашку диаметром 8см требуется 15-20ml агара):
- подписать чашки;
- агар довести до кипения и кипятить 0.5-1' (для того, чтобы расплавились маленькие кусочки агара, которые могут при остывании выступать как центры "кристаллизации");
- остудить (лучше с покачиванием) до ~50-60oС (банку с такой температурой можно держать в руке 1-2');
если заливается немного чашек:
* раскапать по чашкам соответствующие антибиотики и добавки (но не X-Gal, так как DMFA быстро растворяет полистирен; его вносить прямо в расплавленный агар сразу после заливки.),
* заливать чашки "по одной" (вылить 15-20ml агара (на глаз), смешивать 30-60'');
если заливается много чашек:
* добавить необходимое количество антибиотиков и добавок прямо в банку, смешать,
* разлить по чашкам;
- после заливки следует оставить чашки на 1.5-2h под работающим ламинаром (или, если ламинара нет - в термостате на 37oС вверх дном, чуть приоткрыв) чтобы агар подсох, иначе (i) после хранения в чашке будет полно влаги, (ii) сложно будет втереть шпателем бактерии (чашка всё время будет мокрой);
- замотать парафильмом и хранить перевернув
* чашки без антибиотика - NT, в течении года,
* чашки с антибиотиком - +4oС, в течении полутора/двух недель;
- На 8см чашке можно растереть шпателем ~200µl бактериальной суспензии (однако удобнее не превышать 100µl). Растирать нужно только пока поверхность чашки влажная (дальше шпатель начнёт драть агар). Чашки и хранятся, и инкубируются при 37oС вверх дном.
Колбы и пробирки.
- Должны быть подписаны (название плазмиды, дата). Культуру бактерий в пробирке можно хранить в холодной комнате 1-2 месяца. Допустимые количества среды для посуды различной ёмкости (превышать эту ёмкость просто нет смысла, так как из-за плохой аэрации получится даже меньший выход бактерий):
| 16ml стеклянная пробирка | 3-5ml |
| 100ml коническая колба | 5-25ml |
| 250ml коническая колба | 20-100ml |
| 500ml коническая колба | 50-200ml |
| 1l коническая колба | 100-400ml |
| 2l коническая колба | 300-600ml |
|
- Пробирки устанавливаются в качалке под углом ~45o. Для хорошей аэрации нужно, чтобы крышка колбы позволяла воздуху проникать в колбу.
- Очень удобно, если у конической колбы в нижней части есть 2-3 вдавливания. В этом случае среда перемешивается и насыщается кислородом значительно эффективнее.
|
