Трансформация дрожжей плазмидной ДНК | Практическая молекулярная биология

Комментарии.

Общие.

Источник: "MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 2 User Manual", Clontech.
Если требуется максимальная компетентность, то клетки следует использовать в течении часа после приготовления. При необходимости клетки можно использовать и через несколько часов, но их компетентность будет несколько ниже.
Компетентность получается примерно 10⁴-10⁵ колоний/µg плазмиды.
AD плазмида кодирует домен активации, BD плазмида - домен связывания. В двугибридной системе "MATCHMAKER GAL4 Two-Hybrid System 2" используются AD и BD домены дрожжевого транскрипционного фактора GAL4. Соответствующие вектора называются pACT2 и pAS2-1.
В качестве BD домена также часто используется бактериальный белок LexA.
В данной двугибридной системе используются дрожжи дефектные по синтезу лейцина, триптофана и гистидина и не способные расти на среде без этих аминокислот. Плазмида pACT2 содержит ген LEU2, плазмида pAS2-1 ген TRP1. Дрожжи трансформированные pACT2 могут расти на среде SD-leu, трансформированные pAS2-1 - на среде SD-trp, обеими плазмидами - на среде SD-leu-trp. Колонии растут на среде SD-leu-trp-his, если содержат AD и BD плазмиды, кодирующие два взаимодействующих белка, так как в этом случае происходит активация репортерного гена HIS3.

По пунктам.

п. 1.

Среда в эппендорфе должна стать заметно мутной.

п. 1,2.

Для подроста дрожжей, предварительно трансформированных плазмидой, использовать селективную среду (либо SD-leu, либо SD-trp в зависимости от типа плазмиды). Для подроста нетрансформированных дрожжей использовать YPD.

п. 3.

Должны подрости до OD₆₀₀>1.5.

п. 5.

Должны подрости примерно до OD₆₀₀=0.5.

п. 6.

Можно осадить за несколько раз.

п. 11.

Для трансформации AD и BD плазмид можно использовать как одновременную трансформацию, так и последовательную. При последовательной трансформации сначала трансформируется одна плазмида, затем подращиваются трансформированные дрожжи в селективной среде, из них готовятся новые компетентные клетки и в них трансформируется вторая плазмида. Эффективность последовательной трансформации значительно выше, но требует дополнительного времени на подрост дрожжей после первой трансформации.
Непосредственно перед использованием денатурировать геномную ДНК в кипящей бане 10', сразу в лед.

> Методы > Двугибридная система > Трансформация дрожжей плазмидной ДНК. Трансформация дрожжей плазмидной ДНК.		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
Приготовление компетентных клеток. Трансформация. Растворы. YPD среда SD среда TE/LiAc PEG/LiAc Геномная ДНК Комментарии. Общие. По пунктам.	Этот протокол используется для трансформации дрожжей плазмидной ДНК в дрожжевой двугибридной системе от Clontech.
Приготовление компетентных клеток. Суспендировать несколько колоний дрожжей в 1ml YPD или SD среды; В колбу с 50ml YPD или SD среды посеять 1ml дрожжей из п.1; Растить 16-18h при 30^oC; В колбу с 300ml YPD посеять ночную культуру до OD₆₀₀=0.2-0.3; Растить 3h при 30^oC; ЦФ в 50ml нунках 5', 4500rpm, RT; Суспендировать осадок в 50ml H₂O; ЦФ 5', 4500rpm, RT; Суспендировать осадок в 1.5ml свежеприготовленного раствора "TE/LiAc"; Трансформация. Приготовить раствор "PEG/LiAc"; В эппендорфе смешать: плазмида BD: 0.1µg плазмида AD: 0.1µg геномная ДНК: 100µg; Добавить 100µl компетентных клеток, хорошо смешать; Добавить 600µl раствора "PEG/LiAc"; Встряхивать на бактериальном шейкере 30^oC, 30'; Добавить 70µl DMSO, смешать; Heat shock 42^oC, 15'; Охладить клетки во льду 2'; ЦФ 5'', 14000rpm; Суспендировать осадок в 500µl 1xTE; Высеять на чашку с селективной средой.