Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Работа с бактериями > Химически компетентные клетки.

Трансформация бактерий.


Главная.
Новости.
О проекте.
Справочник.
Рестриктазы.
Методы.
Растворы.
Расчёты.
Обзоры.
Обучение.
Ссылки.
Скачать сайт.

Образовательные
ресурсы.

Приготовление компетентных клеток.
Контрольная трансформация.
Реальная трансформация.
Вычисление времени роста.
Растворы.
TB
SOC, SOB
bMeEtOH
2M Mg-solution
Комментарии.
Общие.
По пунктам.
Химически компетентные клетки можно трансформировать неочищенной лигазной смесью (и вообще DNA, находящейся в умеренно солевом буфере). Количество клеток в химически-компетентной фасовке значительно меньше чем в электрокомпетентной, поэтому можно высевать всю фасовку на одну чашку.

    Приготовление компетентных клеток.

  1. со стока (-70oС) рассеять бактерии штрихом на чашку с селективной средой;
  2. выращивать 37oС, ON;
  3. несколько колоний (10-12) диаметром ~2-3mm поместить в 40ml SOB в колбе 0.5-1.0L.
  4. интенсивно встряхивать (200-300rpm)

    5. * либо при 37oС - компетентность среднего уровня, но время роста небольшое,
    * либо при 18oС (переставить качалку в холодную комнату) - компетентность выше, но время роста - несколько суток;

  5. растить OD600= 0.6

    6. все дальнейшие манипуляции проводить на холоду.

  6. в 50ml цф-пробирку поместить 30ml культуры;
  7. 0oC, 10-15';
  8. ЦФ 2-3krpm 4oC, 10', слить супернатант;
  9. ЦФ 2-3krpm 4oC, 20'', тщательно удалить остатки жидкости;
  10. суспензировать в 10ml TB;
  11. 0oС, 10-15';
  12. повторить п.7, 8;
  13. ресуспензировать в 2ml TB;
  14. + DMSO до 3.5% (70µl);
  15. 0oС, 10-15';
  16. повторить п.14,15;
  17. разаликвотить по 100µl в охлажденные 2ml пробирки с завинчивающимися крышками;
  18. заморозить в жидком азоте;
  19. хранить в жидком азоте (лучше) или на -70oС.

    20. Контрольная трансформация.
  20. приготовить из 100х стока (0.5µg/ml) свежий раствор pDNA 5ng/ml;
  21. оттаять во льду 0.5M bMeEtOH и аликвоту клеток;
  22. к аликвоте компетентных клеток добавить:

    23. 4µl 0.5M bMeEtOH,
    2µl (10pg) pDNA;

  23. 0oC, 20-60';
  24. 42oC, 30'', без встряхивания;
  25. сразу в лед, 2';
  26. + 400µl SOC;
  27. плотно завинтить крышку, встряхивать горизонтально на бактериальном шейкере 37oС, 30';
  28. высеять 50µl на чашку с антибиотиком;
  29. если выросло "N" колоний, то компетентность = Nх106[колоний/µg].

    30. Реальная трансформация.

    1. аналогично "контрольной";
    2. на одну аликвоту можно брать pDNA в объёме <10µl;
    3. высев - в зависимости от задачи:

      4. * если требуется получить несколько индивидуальных колоний (например, при создании генно-инженерной конструкции), то высеять 100-200µl (обязательно неравномерно - растереть шпателем по одной половине чашки, и только когда жидкость подсохнет, сделать один (!) мазок по второй половине),
      * если требуется получить как можно больше колоний при разумной плотности (например, при создании библиотеки), то высеять 10-50µl для определения титра (равномерно), оставшиеся клетки хранить ON при 0oС (титр при этом не изменяется). На следующий день рассчитать количество клеток на высев, высеять.

    Вычисление времени роста бактерий.

    Методика приготовления компетентных клеток довольно проста, единственная занудная операция - контроль оптической плотности. Представленная ниже форма поможет "прогнозировать" рост бактерий. Объяснение принципа работы формы и подробная инструкция откроется в новом окне при нажатии на эту кнопку:   

    Красной звездочкой (*) отмечены поля, обязательные для заполнения. Для оценки времени роста требуется провести в разное время два измерения оптической плотности. В форму вводятся время измерений и соответствующие оптические плотности.


    Первое измерение проводилось дня назад в:
       h* min* => OD1 = *
    Второе измерение проводилось сегодня в:
       h* min* => OD2 = *

    Бактерии вырастут до нужной плотности

    через дней в:
              =>ODf = *  

       Или, через   после второго измерения.

     

    Оценить точность вычисления времени.

    применять после оценки времени

      Точность спектр. измерений: ±OD
      Точность для введенного времени: ±t[min]
      Точность полученной оценки: ±t[min]
         		 ± *
    ± *
    ± 

     
    Восстановить для всех форм

    Растворы.

    TB

    (хранить при 4oС)

    Конц.Сток0.5L1L
    PIPES10mM302.37g/M1.51g3.02g
    MnCl2x2H2O55mM161.9 g/M4.45g8.90g
    MnCl2x4H2O 197.91g/M 5.44g 10.89g
    CaCl2x2H2O15mM147.02 g/M1.10g2.21g
    KCl250mM74.55 g/M9.32g18.64g
    H2O mQ   
  • смешать все компоненты, кроме MnCl2, довести KOH pH до 6.7(~650 µl 1N на 0.5L TB). Добавить MnCl2, стерилизовать фильтрацией через 0.45µm фильтр.
  • Если вместо PIPES использовать HEPES,то:
    • HEPES10mM238.3g/M1.19g2.38g

    SOC, SOB

    (хранить при NT).

    Сток200ml400ml
    Bactotriptoneтв.4.0g8.0g
    Bacto Yest extr.тв.1.1g2.2g
    NaCl5M0.4ml0.8ml
    KCl1M2.0ml4ml
    H2OmQ~196ml~391ml
    1. автоклавировать, охладить до <60oС;
    2. добавить:

      3. 0.01V 2M Mg2+{= 1M MgCl2+1M MgSO4}   
      0.01V 2M glucose;   

    3. фильтровать через 0.2µm фильтр;
    4. аликвотить, хранить при -20oC, (-70oC).

    SOB получается, если не добавлять глюкозу.

    bMeEtOH

    0.5M (хранить при +4oС).

    Конц.Сток1ml
    bMeEtOH0.5M14.3M35µl
    H2O mQ965µl

    2M Mg-solution

    (стерилизовать автоклавированием, хранить при NT), p=1.173:

    Конц.Сток100ml
    MgCl2x6H2O1M203.3g/M20.33g
    MgSO4x7H2O1M246.47g/M24.65g
    H2O mQ72.3ml


    Комментарии.

    Общие.

  • Источник: H.Inoue, H.Nojima, H.Okayama "High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids", Gene, 96(1990), 23-8.
  • В данной методике доля компетентных клеток ~10%.
  • Частота трансформации постоянна до ~10ng pDNA/100µl клеток, далее весьма быстро падает.
  • Насыщение в районе 100-200ng/100µl клеток.
  • >25ng/100µl клеток - с заметной частотой появляются двойные трансформанты.
  • В случае большого количества простых трансформаций (например, клонирование плазмид) работу можно значительно ускорить, если (i) брать для трансформации маленький объём клеток (~20µl), (ii) высевать штрихом сразу после теплового шока (без "оживления").
  • Мы читали и слышали совершенно разные мнения о требованиях, предъявляемых к качеству DMSO. Поэтому на всякий случай пользуемся "Sigma, #D2650", расфасованным под аргоном (аликвоты в ампулах по 5 или 10ml). Фасуем его один раз и храним фасовки при -70oС.
  • Основные преимущества химически компетентных клеток перед электрокомпетентными:
    1. Химически компетентные клетки можно трансформировать неочищенной лигазной смесью (и вообще DNA, находящейся в умеренно солевом буфере). В случае электрокомпетентных - DNA должна быть очищена, т.к.: (i) слишком высокая концентрация соли способна вызвать искровой разряд в ячейке (ii) при электротрансформации в оболочке E. coli появляются дырки, в них может проникнуть фермент, используемый для лигирования.
    2. Количество клеток в электрокомпетентной фасовке значительно больше, чем в химически-компетентных, поэтому не стоит пытаться высевать на одну чашку слишком большую долю фасовки. Это чревато подростом (появлением сателлитных колоний) и снижением компетентности.

    По пунктам.

    п.4, 5.

  • Рост при 37oС приводит к резкой (с острым максимумом) зависимости компетентности от плотности клеток (A600=0.45 для DH10B). При 18oС высокая компетентность достигается в широком интервале A600=0.35-0.70.
  • Связь концентрации клеток с оптической плотностью: OD550=c[cells/ml]*108/k.
    • Штаммkдиапазон OD550
    JM1091.10.36-0.64
    SURE1.60.25-0.44
    XL-1Blue2.00.20-0.35
    XL-1BlueMRF'1.90.21-0.37

    п.10.

  • PIPES в составе TB можно заменить на HEPES или BES. Это приведёт лишь к небольшому уменьшению компетентности. Эффективность трансформации практически постоянна в диапазоне pH 5.6-7.0, однако при pH>7.0 MnCl2выпадает в осадок.

    • п.14.

  • DMSO токсичен для бактерий в высокой концентрации (это позволяет не заботится о его стерильности), поэтому он добавляется к клеткам в два этапа. Причем, лучше добавлять так, чтобы не возникало зон "высокой концентрации" (но погружать конец типчика в суспензию клеток нельзя - DMSO замерзнет и закупорит тип). Либо по каплям при постоянном перемешивании, либо нанести на стенки охлажденной пробирки (где DMSO замерзнет), с которых смыть, помешивая пробирку.

    • п. 17.

  • Непроверенная информация Пробирка должна быть пластиковой, применение стеклянной пробирки может понизить эффективность приблизительно в 10 раз (по видимому, из-за адсорбции DNA на стекло).

    • п. 18.

  • Непроверенная информация Замораживание в жидком азоте (холодовой шок) повышает компетентность в 4-5 раз.
  • Непроверенная информация Влияние размера плазмиды на эффективность трансформации: молярная частота практически постоянна для размеров ~3-7.5kb;

    • для 10kb ~ 50%;
    для 13kb ~ 27%;
    для 17.5kb ~ 15%.

    п.24.

  • Тепловой шок: температура может быть в интервале 40-50oС.
  • Непроверенная информация Есть сообщение, что если тепловой шок заменить "замораживанием в жидком азоте (1'), оттаиванием (до NT)", то компетентность повысится в ~10 раз.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100

Hosted by uCoz