Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Работа с бактериями > Электрокомпетентные клетки.

Электропорация.


Главная.
Новости.
О проекте.
Справочник.
Рестриктазы.
Методы.
Растворы.
Расчёты.
Обзоры.
Обучение.
Ссылки.
Скачать сайт.

Образовательные
ресурсы.

Приготовление электрокомпетентных клеток.
Обработка лигазной смеси.
Электропорация с помощью ячеек Bio-Rad.
Приготовление библиотеки.
Вычисление времени роста.
Растворы.
YENB
Комментарии.
Общие.
По пунктам.
Электропорация позволяет получить максимально возможную в настоящее время компетентность клеток. Процедура очень быстрая и удобная, но, к сожалению, относительно дорогая. Основное неудобство – требуется очищенный препарат DNA (с неочищенными либо проскакивает искра, либо компетентность становится даже ниже, чем у "обычных" химически компетентных клеток).

    Приготовление электрокомпетентных клеток.

  1. снять петлей с чашки с соответствующим селективным антибиотиком несколько (5-20) колоний, поместить в 500ml YENB в 2L колбе;
  2. 200-300rpm, ~8h 37oС, качать до OD600=0.7 (годится диапазон 0.5-1.0);

    3. все дальнейшие манипуляции проводить на холоду (заранее охладить до 0oС H2O mQ и 10% glycerol):

  3. охладить: 0oС, ~5';
  4. ЦФ 7' 4.5krpm, слить жидкость, дополнительно ЦФ 5'' 3krpm;
  5. 2х промыть 100ml H2OmQ (ЦФ 7' 4.5krpm, слить жидкость, дополнительно ЦФ 5'' 3krpm);
  6. промыть 20ml 10% glycerol;
  7. добавить объем 10% glycerol, равный объему клеток (должно получиться ~0.7-2.0ml суспензии), ресуспензировать;
  8. аликвотить ( одна aликвота на электропорацию 40µl, поэтому объём аликвоты должен быть кратен 40 µl), заморозить в жидком азоте;
  9. хранить при -70oС.

    10. Обработка лигазной смеси.

  10. после завершения лигирования инактивировать T4 лигазу: 70oC, 10';
  11. диализ (~20µl) на 0.025µm мембране (блестящая сторона вверх) против 30-200ml (0.1х ТЕ) 1h, 4oC;
  12. перенести в новую пробирку;
  13. 1µl на электропорацию (в соответствии с инструкцией к прибору);

    14. Электропорация с помощью ячеек Bio-Rad.

  14. ячейку заранее остудить во льду (~5-10');
  15. оттаять необходимое количество клеток во льду. Когда оттают - смешать типчиком не пипетируя;
  16. к аликвоте DNA (в охлажденной пробирке) добавить 40µl компетентных клеток;
  17. смешать типчиком (но не пипетировать!);
  18. перенести в ячейку электропоратора;
  19. параметры электропорации: 1.8 kV, 25µF, 200 Ом, зазор ячейки 0.1cm (у нас получалось время импульса 3.9-4.6ms);
  20. после импульса вымыть клетки из ячейки 1ml SOC (потребуется пипетировать 2-3 раза);
  21. перенести в 15ml пластиковую пробирку, качать ~30' 37oC;

    22. Приготовление библиотеки.

  22. + 1ml SOC/20% глицерол, смешать;
  23. 20µl высеять на определение титра, все остальное расфасовать по 200µl в подписанные пробирки и быстро заморозить в жидком азоте;
  24. хранить при -70oС.

    25. Вычисление времени роста бактерий.

    Методика приготовления электрокомпетентных клеток довольно проста, единственная занудная операция - контроль оптической плотности. Представленная ниже форма поможет "прогнозировать" рост бактерий. Объяснение принципа работы формы и подробная инструкция откроется в новом окне при нажатии на эту кнопку:   

    Красной звездочкой (*) отмечены поля, обязательные для заполнения. Для оценки времени роста требуется провести в разное время два измерения оптической плотности. В форму вводятся время измерений и соответствующие оптические плотности.


    Первое измерение проводилось дня назад в:
       h* min* => OD1 = *
    Второе измерение проводилось сегодня в:
       h* min* => OD2 = *

    Бактерии вырастут до нужной плотности

    через дней в:
              =>ODf = *  

       Или, через   после второго измерения.

     

    Оценить точность вычисления времени.

    применять после оценки времени

      Точность спектр. измерений: ±OD
      Точность для введенного времени: ±t[min]
      Точность полученной оценки: ±t[min]
         		 ± *
    ± *
    ± 

     
    Восстановить для всех форм

    Растворы.

    YENB

    (pH 7.5):

    Конц.Сток0.45 L0.5 L0.9 L1.0 L
    Бакто-дрож. экст.0.75%тв.3.4g3.75g6.75g7.5g
    Nutrient Broth0.8%тв.3.6g4.0g7.2g8.0g
    NaOH 10N~243 µl~270 µl~490 µl~540 µl


    Комментарии.

    Общие.

  • Мы получали компетентность

    • ~7x108 (BMH71-18mutS),
    ~1.5x109 (XL1-Blue).

  • Если при электропорировании в ячейке проскакивает искра, это не означает наверняка, что лигазная смесь или клетки плохого качества. Мы не можем дать этому вразумительного объяснения, но часто достаточно повторить электропорирование с той же лигазной смесью и тем же лотом клеток, чтобы все было хорошо.
  • Химически компетентные клетки можно трансформировать неочищенной лигазной смесью (и вообще DNA, находящейся в умеренно солевом буфере). В случае электрокомпетентных - DNA должна быть очищена, т.к.:
    1. слишком высокая концентрация соли способна вызвать искровой разряд в ячейке;
    2. при электротрансформации в оболочке E. coli появляются дырки, в них может проникнуть фермент, используемый для лигирования.

    От соли обычно можно избавиться микродиализом. Самый простой способ избавиться от фермента - нагрев (но в случае топоизомеразы {кит от Invitrogen} он не помогает).

  • Количество клеток в электрокомпетентной фасовке значительно больше, чем в химически-компетентных, поэтому не стоит пытаться высевать на одну чашку слишком большую долю фасовки. Это чревато подростом (появлением сателлитных колоний) и снижением компетентности.

    • По пунктам.

    п.1.

  • Число колоний зависит от их размера.
  • Среда YENB - бессолевая. Это упрощает отмывку бактерий при приготовлении электрокомпетентных клеток.

    • п.10.

  • Инактивация лигазу увеличивает эффективность трансформации в ~10 раз, диализ - еще в ~50 раз.
  • Если такой мембраны нет, лигазную смесь можно легко обессолить в лунке, полученной при застывании 1.5% агарозы (в 100mM glucose) в 1.5ml микроцентрифужной пробирке со вставленным в неё желтым типчиком (чтобы образовалась ячейка объёмом 30-100 µl). Обессоливание проходит ~90' на 4oС.

    • п.11.

  • Мембрана: (Millipore MF, VSWP01300). Подчеркнутые цифры обозначают диаметр мембраны в mm. Более крупные мембраны относительно дешевле. Для диализа можно брать не целую мембрану, а разрезать ее на кусочки - лишь бы умещалась капля лигазной смеси.

    • п.22.

  • Мы добавляем глицерин как 20% раствор, т.к.
    1. при этом проще измерять его объем;
    2. нам кажется, что эта процедура мягче (меньше повреждает бактерии), чем добавление 100% глицерина.

    п.23.

  • На пробирках должно быть название библиотеки и дата изготовления. Лучше, если после определения титра Вы не поленитесь прилепить к пробиркам ещё и титр.
  • Замораживание в жидком азоте (вопреки широко распространенному мнению) совершенно не изменяет титр библиотеки (по крайней мере, для штамма DH10B).
  • Для определении компетентности взять 2µl 5ng/ml pDNA, высеять 10µl (+ 40µl SOC, чтобы легче растирать на чашке). Если выросло N колоний => компетентность Nx107(колоний/µg).

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100

Hosted by uCoz