Гибридизация бактериальных колоний | Практическая молекулярная биология

Комментарии.

Общие.

В основном этот метод имеет смысл применять, когда есть необходимость проверить большое количество клонов на наличие вставки в плазмиде (например, при низкой эффективности клонирования или при одновременном клонировании большого количества фрагментов). При умеренном количестве клонов проще проверить наличие вставки с помощью PCR. Так же этот способ удобен, если отсутствуют другие возможности для проверки: отсутствует сине-белый тест, нет возможности для проверки с помощью PCR-реакции, и.т.д.
Скорость перекалывания примерно 150 колоний в час. За день можно переколоть около 1000 колоний, если постараться.

По пунктам.

п.1.

Количество фильтров определяется количеством колоний необходимых для перекола.
Имеет смысл перекалывать колонии рядами, чтобы потом легко можно было локализовать положение гибридизующихся колоний.

п.3.

Для чашки "1" можно увеличить количество антибиотика. Мы используем концентрацию ампициллина 100 и 50 mkg/ml для чашки "1" и "2" соответственно.

п.4.

Фильтр должен быть не мокрым, а влажным. Для этого фильтр смочить в воде и промокнуть фильтровалкой. Двумя пинцетами наложить фильтр на чашку.

п.5.

Анализируемые колонии - это чаще всего клоны после трансформации лигазной смеси.
Мы перекалываем так: нагреваем на газу до красна платиновую петлю, несколько секунд охлаждаем на воздухе, охлаждаем в агаре, берем петлей колонию, перекалываем на фильтр, перекалываем на чашку. Для следующей колонии - та же процедура.
Важно, чтобы колонии не перерастали. Если колонии перерастают, то это ведет к увеличению фона гибридизации. Также желательно перекалывать на фильтр свежие колонии. Они растут равномернее и дают небольшой фон.

п.7.

п.7,8.

Обработку фильтра с колониями проводить следующим образом: в чашку Петри налить 1-1.5ml раствора и положить на его поверхность фильтр колониями вверх, так чтобы раствор равномерно распределился между чашкой и фильтром. Не допускать попадания растворов на верхнюю поверхность с колониями ( особенно NaOH), иначе это приведет к тому, что колонии расползутся по фильтру. Перед обработкой следующим расвором фильтр промакивать фильтровалкой, не касаясь поверхности с колониями.

п.10.

п.11.

В качестве зонда обычно берется клонируемый фрагмент. При одновременном клонировании большого количества фрагментов можно использовать смесь зондов или гибридизовать в разных стаканах.
Скорее всего гибридизацию можно вести и в других буферах, типа HSB, но мы не проверяли.

п.12.

При закладке на экспозицию скрепить скотчем пленку и фильтр в нескольких местах.

п.13.

Перед проявкой проколоть и фильтр и пленку в трех местах, потом по проколам совместить. Обычно негибридизующиеся колонии дают небольшой фон и поэтому легко определить координаты положительного сигнала.