Выделение одноцепочечной ДНК | Практическая молекулярная биология

Комментарии.

Общие.

выбор бактериального штамма

Так как заражение бактерии одноцепочечным фагом происходит через F'-пили, необходимо, чтобы используемый штамм содержал f'-фактор.
Бактерии могут терять f'-фактор, поэтому в лабораторных штаммах в нём размещены гены, обеспечивающие возможность положительной селекции F'⁽⁺⁾-бактерий. В "старых" штаммах для этого используются гены, отвечающие за производство аминокислот (селекция на минимальной среде). В "современных" штаммах используются гены устойчивости к антибиотикам. Селекция на среде с антибиотиком гораздо удобнее, но требует определённой внимательности.

если штамм устойчив к канамицину (XL-2Blue) его нельзя использовать в описанной выше методике с фагом-хелпером VCSM13, так как селекция на VCSM13 заражение не будет работать;
удобство селекции F'⁽⁺⁾-бактерий вызывает соблазн добавлять антибиотик во все ростовые среды (хотя вполне достаточно проводить селекцию только перед приготовлением компетентных клеток). Иногда это приводит к плачевным результатам. Наш опыт показывает, что добавление тетрациклина мешает выделению одноцепочечной (резко снижается выход) и плазмидной DNA (бактерии начинают слипаться, плохо суспензируются в растворе "I", легко разрушаются => снижаются выход и качество). Возможно, что подобными побочными эффектами обладают и другие антибиотики.

Если требуется постоянно получать ssDNA, то удобно иметь компетентные клетки уже зараженные фагом-хелпером. Коротко, процедура выглядит следующим образом:

заразить небольшое количество клеток VCSM13;
высеять штрихом на чашку с LB/канамицин;
далее - как при приготовлении обычных компетентных клеток за исключением того, что культура выращивается в SOB/канамицин.

Приятная черта одноцепочечных бактериофагов: их оболочка линейная, ее размер определяется размером пакуемой DNA. Теоретически этот размер может быть любым, практически, с фагемидами >15 kb могут быть проблемы.
Сравнение фагемид с векторами на основе М13:

вставка в векторах на основе М13 часто нестабильна,
фагемиды имеют существенно меньшие ограничения на размер клонируемого фрагмента (до 10kb),
для получения одноцепочечной DNA из фагемид не требуется клонирования;
у фагемид выход одноцепочечной DNA раз в 10-100 меньше, чем для М13,
у фагемид часто выход неустойчив.

Альтернативный протокол выделения ssDNA:

* "нормальный протокол" вплоть до осаждения PEG;
* ресуспензировать в 50 µl TE,
либо 1х экстракция нейтральным фенолом,
либо добавить равный объём формамида, 15' 55^oС,
* очистка на Glass milk.

По пунктам.

п. 1.

Фагемида содержит участки начала и конца репликации одноцепочечного фага М13. Для аппарата репликации одноцепочечных фагов, который экспрессирует фаг-помощник, этих участков достаточно, чтобы сделать одноцепочечную копию с плазмиды, упаковать ее и вывести из бактериальной клетки.
Фаг-хелпер - производная одноцепочечного фага М13, которая имеет небольшие проблемы с собственной репликацией (отчасти связанные просто с большим размером). VCSM13, кроме того, имеет ген устойчивости к канамицину, который можно использовать для положительной селекции зараженных бактерий.

п. 3.

Селекция против незараженных бактерий. Одноцепочечные фаги семейства М13 (в отличие от лямбда фага) не лизируют зараженные ими бактерии. Они реплицируются, упаковываются и выходят из бактерии не мешая ей жить и делиться. Однако, метаболическая нагрузка на бактериальную клетку так велика, что если какая-то бактерия умудрится избежать заражения, то она легко обгонит в росте зараженных.

п. 6.

Бактериальные клетки - в осадке, фагемиды - в растворе.

п. 7.

Осаждение бактериофага PEG/NaCl.

п. 8.

На этом этапе можно прерваться (+4^oC, ON).

п. 12.

Очистка DNA бактериофага от компонентов белковой оболочки с помощью фенола.

п. 13.

На этом этапе можно прерваться (+4; -20^oC, несколько суток).

> Методы > Одноцепочечные фаги > Выделение ДНК. Выделение одноцепочечной ДНК.		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
Выделение одноцепочечной ДНК. Взаимная гибридизация. Растворы. PEG/NaCl AcONa/EDTA 2xYT/Amp/Ph.helper Комментарии. Общие. По пунктам.	По сравнению с векторами на основе М13 фагемиды имеют два достоинства: (i) существенно меньшие ограничения на размер клонируемого фрагмента (до 10kb); (ii) для получения одноцепочечной DNA из фагемид не требуется дополнительного клонирования; и два недостатка: (i) выход одноцепочечной DNA раз в 10-100 меньше, чем для М13; (ii) часто выход неустойчив.
Выделение одноцепочечной ДНК. проверить, что используемый штамм содержит F'-фактор. Проверить, не несёт ли штамм или вектор ген устойчивости к канамицину (если несёт - использовать только R408 фаг-хелпер). перенести в 2.5ml 2xYT/Amp/Ph.helper (17ml пробирка): с чашки - колонию петлёй, из ночной культуры - 2µl; только для VCSM13: качать 200-300rpm, 37^oС, 1-2h с хорошим аэрированием; добавить канамицин до 70µg/ml; качать 200-300rpm, 37^oС, 16-24h с хорошим аэрированием; 2ml культуры -> в 2ml пробирку; ЦФ NT, 5-10'; 1.7ml супернатанта -> в 2ml пробирку с 275µl PEG/NaCl (финальное соотношение 162 µl/ml); 0^oС 15'; ЦФ NT, 5'; сбросить супернатант; ресуспензировать осадок в 400µl AcONa/EDTA; экстрагировать Ф:Х, Х; + 1ml EtOH, осадить; промыть 70% EtOH; растворить в 6µl H₂O; определить концентрацию на форезе. Взаимная гибридизация. Позволяет быстро определить, действительно ли ориентации двух клонированных фрагментов противоположна. смешать ssDNA №1 => ~0.1µg ssDNA №2 => ~0.1µg NaCl 5M => 0.6µl/до 150mM H₂O => до 20µl; 65^oС, 1h; добавить буфер внесения, форез (в качестве контролей ssDNA №1 или ssDNA №2); если ориентация противоположная, то появляются гибриды с меньшей электрофоретической подвижностью.