Комментарии.
По пунктам.
п. 1.
- Ночную культуру можно хранить 2-4 дня при 4oC
- Состав среды:
* LTB - предпочтительнее, чем богатые среды (LB, SOB), так как клетки растут медленнее и ночная культура не успевает достичь насыщения;
* Mg - в отсутствии Mg2+оболочка фага лямбда нестабильна;
* мальтоза - стимулирует экспрессию бактериями мальтозного рецептора (связываясь с этим рецептором фаг лямбда проникает в клетку). Ни в коем случае не используйте среду с глюкозой - катаболитная репрессия приведет к выключению мальтозного оперона.
 Есть сообщение, что включение в ростовую среду 0.3% глицерина существенно (в 10 раз) увеличивает выход фага.- Рост. Можно выращивать и при 37oС, но при этом требуется контролировать плотность бактерий, чтобы не допустить перехода клеток в стационарную фазу.
п. 2.
- Для того, чтобы фаг нормально вырос, важно, чтобы бляшка была свежей - не более 2-х дней. Если она старая, лучше пересеять.
- Капля хлороформа предотвращает грибковый или бактериальный зарост при последующем хранении.
п. 3.
- Такие фаговые культуры надежно хранятся более года. Если требуется обеспечить действительно долгосрочное хранение - лучше добавить DMSO до 7% и заморозить при -70oС.
п. 4.
- Разрушение фага лямбда связано с гибелью зараженной им бактериальной клетки. То есть в культуре происходят довольно сложные события: одновременно размножаются и бактерии и фаг. Причем последний при этом губит первых. Странно, но несмотря на такую сложную взаимозависимость можно вполне надежно получать культуры фага лямбда с высоким титром.
- Во многих методиках написано, что для успешного роста требуется вносить в среду "оптимальное" соотношение фаг:клетки. Однако, в реальной жизни мы ни разу не видели, чтобы причиной неудачного высева была "передозировка" фага. Обратная ситуация, когда в культуре "не прошел лизис" (передозировка клеток), встречается чрезвычайно часто. По видимому, фаг не способен размножаться на клетках, находящихся в стационарной фазе роста.
Так что, если есть возможность сразу после выкалывания фага с чашки высеять жидкую культуру, мы поступаем следующим образом:
- толстой пастеркой (чтобы захватить прилегающие участки "газона") выколоть бляшку в 200µl SM;
- > 2 часа на качалке;
- 37oС, 15' без качания;
- переходить к п.5.
п. 5
- Бедная среда предпочтительнее, нам кажется, что она снижает шансы бактерий перерасти фаг (см. замечание к п.4.).
- Мальтозу лучше не добавлять. Говорят, что мальтозные рецепторы на оболочках лизировавших бактерий связывают фаг из раствора.
п. 6.
- Культура бактерий должна вначале вырасти до весьма заметной плотности (обычно 5-12h). Затем, в течении относительно короткого (0.5-2 h) времени происходит лизис. Культура становиться практически полностью прозрачной, от бактерий остаётся только преципитат в виде крупных хлопьев или клубка нитей.
п. 7.
- Мы читали, что эта процедура вызывает лизис тех клеток, в которых бактериофаг лямбда уже размножился. Сами мы дополнительного лизиса никогда не видели и добавляли хлороформ по тем же причинам, что и в п.2.
- В этом месте можно прерваться и оставить колбы на несколько суток при +4oС.
п. 8.
- Охлаждение для того, что бы RNase и DNase работали при NT.
п. 9.
- Эта процедура дублирует п.21. Если DNA фага лямбда не должна быть высокого качества, эти пункты можно опустить. Дополнительное расщепление DNA и RNA введено потому, что за один раз очиститься от этих примесей сложно.
п. 11-13
- На этом шаге осаждаются не лизировавшие клетки и преципитат, оставшийся от лизированных. Перед центрифугированием добавляется NaCl, т.к. это позволяет снять с бактериальных оболочек и перевести в раствор фаг лямбда, прилипший к мальтозным рецепторам.
п. 13, 16
- Можно проводить центрифугирование и при 4.5kg.
п. 15
- Преципитация PEG(ом) бактериофага лямбда.
- В этом месте можно прерваться и оставить преципитацию на несколько суток при +4oС.
п. 16.
- Если используется угловой ротор, то лучше отметить ту сторону пробирки, где будет располагаться осадок, т.к. он мало заметен.
п. 18.
- В этом месте можно прерваться и оставить суспензию на несколько суток при +4oС.
п. 19.
- Экстракция хлороформом вызывает преципитацию PEG и сохранившихся, не смотря на обработку в п. 11-13, компонентов бактерий.
п. 20.
- Очень (!!!) важно не превышать указанную скорость центрифугирования, иначе фаг лямбда уйдёт в интерфазу. Видимо, при центрифугировании на высокой скорости образуется плотная "подушка" PEG которая может утянуть с собой в интерфазу ~90% лямбда. А лучше даже и указанное центрифугирование проводить в два этапа (сначала 1krpm, а затем 3krpm).
п. 21.
- PEG осаждает не только бактериофаг лямбда, но так же DNA и RNA, от которых нужно избавиться.
п. 23.
- Разрушение белковой оболочки бактериофага.
- EDTA - связывает ионы Mg2+ это:
а) останавливает работу DNase из п.21;
б) дестабилизирует фаговую оболочку.
- SDS - денатурация белков (нуклеаз из п.21 и фаговых).
- Prot K - расщепление белков (нуклеаз из п.21 и фаговых).
|
