In vivo выщепление pSK(-) из лямбда ZAP | Практическая молекулярная биология

Комментарии.

Общие.

Область начала репликации одноцепочечных бактериофагов можно разделить на две части: 1) сайт инициации, 2) сайт терминации синтеза DNA. В векторе лямбда ZAP эти сайты клонированы раздельно и содержат внутри себя последовательность pSK(-). Фаг-хелпер проводит выщепление фагемиды pSK(-) из лямбда ZAP, ее упаковку и секрецию в среду. Штамм SOLR устойчив к инфекции фагом лямбда. Он так же не способен комплементировать амбер-мутацию фага ExAssist. Без этой супрессии ExAssist не способен осуществлять свою репликацию. Т.о. в этих клетках могут размножаться только фагемиды pSK(-).

По пунктам.

п. 1, 2.

Элюция лямбда ZAP в SM.

п. 3.

XL1-Blue - с чашки LB/Tet. (Tet.: 12.5µg/ml => 2.5µl/ml стока 5µg/µl);
SOLR - с чашки LB/Kan. (Kan.: 50µg/ml => 0.5µl/ml стока 100µg/µl).
Обе культуры можно хранить при +4^oС в течении недели.

п. 4, 5.

Клетки XL-1Blue заражаются лямбда ZAP и одноцепочечным фагом-хелпером ExAssist, инкубация без встряхивания на 37^oС в п.5. требуется для заражения фагом лямбда.

п. 7.

Фаг-хелпер проводит выщепление фагемиды pSK(-) из лямбда ZAP, ее упаковку и секрецию в среду.

п. 9.

Тепловая обработка убивает все клетки E. coli, на фаги она не действует.

п. 10.

Осаждение погибших клеток. В супернатанте остаются: выщепленная фагемида, фаг-хелпер, фаг лямбда ZAP.

п. 11.

Штамм SOLR обладает забавным свойством: плазмидная DNA, полученная из этого штамма образует широкий спектр конкатамеров. Эта особенность способна вызвать замешательство при сравнении ее на электрофорезе с pDNA, выделенной из таких штаммов, как DH10B, XL1-Blue.

п. 13, 18.

На этом этапе можно добавить в среду глицерин до 7.5-15% и хранить клетки при -20^oС (а лучше при -70^oС).
Селекция на Amp отбирает клетки, несущие pSK(-). Высев должен быть чрезвычайно неравномерным, т.к. обычно вырастает очень много колоний.

> Методы > Фаг лямбда > Вырезание плазмиды in vivo. In vivo выщепление pSK(-) из лямбда ZAP.		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
1-ый день. 2-ой день. Упрощённый вариант метода. Растворы. SM Комментарии. Общие. По пунктам.
1^ыйдень. выколоть бляшку лямбда ZAP, поместить её в пробирку с SM/хлороформ (500µl/20µl), вортекс; качать 1-2h NT или без качания +4^oC, ON; приготовить ночные культуры (бактериальная качалка 200-300rpm, 30^oC, ON): XL-1Blue (3ml LTB/Mg/мальтоза), SOLR (3ml LTB); 2^ойдень. в 1.7ml пробирку поместить: 200µl культуры XL-1Blue, 25-250µl фаговой суспензии из п.2, > 10⁶pfu ExAssist фага-хелпера (обычно 1µl из стока); 37^oС, 15', без встряхивания; перенести в 3ml LB; бактериальная качалка 200-300rpm, 37^oС,>2-2.5h; 1.2ml -> в 1.7ml пробирку; 70^oС, 15'; ЦФ 5'; 100µl супернатанта перенести в пробирку с 200µl SOLR; 37^oС, 15'; высеять 10-50µl (неравномерно!!!) на чашку LB/Amp+Kan. Упрощённый вариант метода. из ночных культур XL1-Blue и SOLR приготовить Bacterial Mix (BM): XL1-Blue + SOLR + ExAssist =1:1:~10⁸pfu/ml; смешать в одной пробирке: 5 µl суспензии фага лямбда, 195 µl BM; 37^oС, 15', без встряхивания; бактериальная качалка 200-300rpm, 37^oС, ~2h; высеять 10-50µl (неравномерно!!!) на чашку LB/Amp+Kan.