Агарозный гель-электрофорез.

Выбор % геля.

Особенности работы с низкопроцентными (0.3%) гелями.

1. в плашку для электрофореза залить "подложку" - слой агарозы 1.5-2.0% толщиной ~2-3 mm, дать застыть;
2. на этой подложке закрепить гребенку так, чтобы между зубцами и подложкой было расстояние 1-2mm;
3. залить 0.3% агарозу (лучше в холодной комнате);
4. гребенку удалять только под слоем буфера, иначе ячейки слипнутся.

ВНИМАНИЕ! Работать в холодной комнате. Гель очень хрупкий, все манипуляции проводить только вместе с 2% подложкой; не лить буфер на поверхность геля. Низкопроцентные гели особенно чувствительны к перегрузке по количеству DNA на дорожку.

Разделение линейных молекул.

Диапазон нормального разделения линейных dsDNA молекул для гелей с различной концентрацией агарозы:

% агарозы 0.3 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.2 1.5 2.0 Размер DNA [kbp] 5-60 1-30 1-20 0.8-12 0.6-10 0.5-8 0.5-7 0.4-6 0.2-3 0.1-2

Меньший предел определяется (в основном) диффузией полосы в геле. Т.е. в гелях с низкой концентрацией агарозы мелкие фрагменты вполне разделяются, но полосы не четкие.

Верхний предел сильно зависит от напряженности поля, при которой проводится форез. Чем меньше напряженность поля, тем более длинные молекулы можно эффективно разделить.

Разделение суперскрученных и кольцевых молекул.

К сожалению относительная подвижность линейных и кольцевых молекул зависит от условий фореза: % геля, скорость фореза (в частности, это означает, что нельзя пользоваться линейным маркером для оценки размера кольцевых молекул).

Приведенная таблица дает некоторое представление о соотношении подвижностей при умеренной (~6V/cm) скорости фореза (в скобках - при более быстром разгоне):

Размер суперскруч. DNA [kbp] Размер линейной DNA [kbp] для различных % агарозного геля 0.7% 1% 1.5% 2% 2 1.2 1.3 1.3 (1.6) 1.5 (1.0) 3 1.7 1.8 2 (2.4) 2.9 (1.8) 4 2.2 2.3 2.7 (3.7) - 5 2.7 2.9 3.5 (5.5) - 6 3.2 3.5 5 (8.5) - 7 3.9 4.2 8.5 (>12) - 8 4.4 5.0 >12 - 9 5.1 5.9 - - 10 5.8 6.8 - - 12 7 8.7 - -

В присутствии 0.5 µg/ml EtBr разрешение релаксированной и суперскрученной pDNA увеличивается примерно в 20 раз при повышении ионной силы буфера до 4хТАЕ. Того же увеличения можно добиться понижая концентрацию EtBr.

Одноцепочечная DNA.

На 1% агарозном форезе ssDNA бежит чуть быстрее (~10%), чем dsDNA того же размера. ssDNA окрашивается EtBr заметно слабее, чем ds (разница в ~4-5 раз). Tо есть, чтобы полосы имели одинаковую интенсивность окраски, требуется взять ~ в 5 раз больше ssDNA.

Чтобы разделить цепи, нужно либо непосредственно перед форезом прогреть ~1' 100^oC, либо добавить к образцу NaOH до 0.1 М, 5-10' (NT или 37^oC);




Напряжённость поля.




При оценке напряженности поля для горизонтального фореза принято пренебрегать конкретной геометрией камеры и измерять расстояние непосредственно между электродами.

На рисунке показана схема форезов, при разном напряжении. Форезы проводились разное время, так, чтобы 0.5kb фрагмент прошел одинаковое расстояние. Видно, что проведение фореза при высоком напряжении эквивалентно уменьшению длины геля.

Разумный компромисс между скоростью и качеством фореза для высококачественных или препаративных форезов: ~2V/cm(можно меньше для ON форезов). Для аналитических форезов приемлемое качество сохраняется до ~6V/cm.

DNA особенно легко теряет EtBr при повышенной температуре (что обычно случается, если гонять форезы при высоком напряжении).

EtBr при форезе движется от (+) к (-). Если хочется, чтобы он не уходил из геля, лучше ввести его и в форезный буфер.

Количество DNA, которое можно наносить на дорожку.

Нижний предел определяется используемым методом детекции. Если применяется окрашивание EtBr, то не стоит надеяться увидеть <10ng на 5mm полоску.

Верхний предел: слишком большое количество DNA на дорожке приводит к двум неприятным эффектам:

1. изменению подвижности полосы в геле (идёт быстрее). Так что не надо сразу паниковать, когда, например, слишком большое количество pDNA идёт быстрее, чем разбавленная исходная плазмида. (к такому же эффекту может привести и слишком большое количество RNA в препарате pDNA).
2. при визуальной или при денситометрической оценке количества DNA получаются заниженные оценки (точность совсем низкая, начиная приблизительно с 0.5 µg на 5mm дорожку). Оптимальный диапазон для денситометрического определения: 0.02-0.15 µg на полоску.

Буфер для внесения.

Присутствие красителя:

* облегчает внесение в лунку;
* позволяет иметь представление, где в геле находится фрагмент;

но в то же время:

* может мешать наблюдению фрагментов под UV;
* может оказаться нежелательной примесью при элюции фрагмента из геля.

Подвижность красителей в гелях с различной концентрацией агарозы:

% Подвижность красителей КЦ Крезоловый кр. Бромфен. синий OrangeG 0.7 ~10.5 (9-15) ~3.8 (3.2-4.5) ~0.8 (0.7-1.2) ~0.15 (0.1-0.2) 0.8 ~8 (7-9) ~2.9 (2.7-3.2) ~0.5 (0.4-0.6) < 0.25 1.0 ~6 (4.8-7) ~2.2 (2-2.5) ~0.5 (0.4-0.6) < 0.25 1.5 ~2.2 (1.8-2.6) ~1.0 (0.9-1.3) ~0.25 << 0.25 2.0 ~0.75 (0.6-0.9) ~0.35 (0.3-0.4) < 0.25 << 0.25

Выбор красителя:

• Бромфеноловый синий и ксиленцианол - (стоковые растворы 1% в H₂O; рабочая концентрация в 1х буфере ~0.005-0.02%) могут заметно мешать наблюдению фрагментов под UV. По нашему опыту, элюция фрагмента в РEG вместе с любым из этих красителей не оказывает заметного влияния на меченье, лигирование и трансформацию.
• Cresol red - (стоковый раствор 50mM в H₂O; рабочая концентрация в 1х буфере ~0.1mM) совместим с ферментативными реакциями, практически не мешает наблюдению под UV.
• OrangeG – (стоковый раствор 1% в формамиде; рабочая концентрация в 1х буфере ~0.01-0.05%) наиболее подвижный краситель, практически всегда находится вне "рабочей зоны". Заметен под UV.

Краситель в буфере нужен лишь для того, чтобы образец был легко заметен в лунке и в геле. Обычно приводимые в методиках ~0.025% для бромфенолового синего и ксиленцианола (в 1х буфере) по нашему мнению слишком большое количество.

Лучше иметь на столе

* буфера с различными красителями.
* различные разведения буфера для внесения (10х, 2х, 1х). При этом образец любого объема собирается из двух компонентов (буфер+образец), а не из трех (буфер+ вода + образец).
1x если объем образца < 25%
2x ==> 25-75%;
10x ==> 75%

Буфер для внесения 10х, (хранить при NT).

Конц. Сток 1ml 5ml 10ml 25ml SDS 0.5% 10% 50µl 250µl 500µl 1.25ml EDTA, pH8.0 0.1M 0.5M 0.2ml 1.0ml 2.0ml 5.0ml глицерол 50% 100% 0.5ml 0.625g 2.5ml 3.125g 5.0ml 6.25g 12.5ml 15.63g H2O   mQ 0.25ml 1.25ml 2.5ml 6.25ml

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru