Комментарии.
Общие.
- 0.25-6kb и 7-12kb DNA ladders безусловно дешевле, удобнее в приготовлении и в использовании, чем маркеры на основе фага лямбда. У него лишь один существенный недостаток: он дает очень сильный фон при гибридизации с фрагментами (даже очищенными), клонированными в плазмидных векторах. Приходится наносить маркер через пустую дорожку от "геномных" полос и отрезать перед переносом. Кроме того, в качестве некоторых вставок были использованы фрагменты из фага лямбда (очень неудачная идея!), так что с зондами, вырезанными из лямбда-векторов этот маркер тоже фонит. Впрочем, аналогичные проблемы возникают и с лямбда/HindIII при гибридизации с фрагментами, вырезанными непосредственно из фагового вектора.
- Все используемые плазмиды имеют слабый контроль и ампициллиновую селекцию. Приблизительный выход из 250ml LB/Amp: ~1mg (для pMr2 и pMr2+2) и ~2.6mg для всех остальных. Поэтому, для того, чтобы получить более или менее сбалансированные количества pDNA:
* если речь идет о приготовлении "Supercoiled marker" надо брать для pMr2 объем среды в 2 раза больший, чем для остальных плазмид;
* если речь идет о приготовлении "1kb marker" надо брать для pMr2+2 объем среды в 4 раза больший, чем для остальных плазмид.
| Название плазмиды: | Размер[bp]: | Количество сайтов рестрикции EcoR I: | Фрагменты, получающиеся в результате рестрикции EcoR I: | Относительное количество сайтов EcoR I: | Приблизи-
тельное количество EcoR I, [u]: |
| pMr2 | 2000 | 1 | 1x2000 | (6) | (6) |
| pMr3 | 3000 | 1 | 1x3000 | (4) | (4) |
| pMr4 | 4000 | 1 | 1x4000 | (3) | (3) |
| pMr5 | 5000 | 1 | 1x5000 | (2.4) | (3) |
| pMr6 | 6000 | 1 | 1x6000 | (2) | (2) |
| pMr7 | 7000 | 1 | 1x7000 | 1.7 | 1.5 |
| pMr8 | 8000 | 1 | 1x8000 | 1.5 | 1.4 |
| pMr9 | 9000 | 1 | 1x9000 | 1.3 | 1.2 |
| pMr10 | 10000 | 1 | 1x10000 | 1.2 | 1.1 |
| pMr12 | 12000 | 1 | 1x12000 | 1 | 1 |
| pMr2+2 | 2500 | 3 | 1x2000+2x250 | 14.4 | 13 |
| pMr3+2 | 4000 | 3 | 1x3000+2x500 | 9 | 8 |
| pMr4+2 | 5500 | 3 | 1x4000+2x750 | 6.5 | 6 |
| pMr5+2 | 7000 | 3 | 1x5000+2x1000 | 5.1 | 5 |
| pMr6+2 | 9000 | 3 | 1x6000+2x1500 | 4 | 4 |
|
По пунктам.
п. 5.
- Обращаем ваше внимание на то, что когда режутся приблизительно одинаковые массы плазмид, молярное количество EcoR I сайтов в реакции сильно различается. Кроме того, EcoR I относится к тем рестриктазам, которые способны работать и в течении ночи, т.е. количество фермента может быть уменьшено В таблице приведены приблизительные количества EcoRI, необходимые для того, чтобы порезать ON 100µg соответствующих плазмид.
п. 3, 7.
- Лучше, перед тем как смешивать большой объём маркера развести индивидуальные компоненты (понемногу!!!) до конечной концентрации и проконтролировать на форезе, что получилось.
- 0.25-6kb и 7-12kb DNA ladders можно при желании объединить в один 0.25-12kb DNA маркер.
- Для получения отчетливой картинки достаточно наносить 0.2-0.5µl смеси на одну дорожку геля.
- Мы предпочитаем хранить основной сток в морозильнике на -20oС и готовить из него по мере необходимости "рабочий сток", который держим при +4С. "Рабочий сток" составляется таким образом, чтобы 10µl давали не слишком яркую, но вполне читаемую картинку на форезе:
| | Конц. | Сток | 500µl |
| Маркер | 0.015µg/µl | 0.5µg/µl | 15µl |
| Буфер для внесения SDS(+) | 1x | 10x | 50µl |
| H2O | | mQ | 435µl |
|
|
