Выделение ДНК из агарозного геля с помощью PEG/TAE | Практическая молекулярная биология

Комментарии.

Общие.

Метод основан на электроэлюции DNA из геля в буферный раствор. Чтобы DNA не проскакивала сквозь лунку, вязкость раствора повышается добавлением 15% PEG.
Видимо аналогичный метод может быть использован и для других форезных буферов, единственная модификация - заменить PEG/TAE на PEG/???.
Вариация метода: для снижения скорости движения DNA используется повышение концентрации соли в буфере. В этом случае в лунку заливается {3xTAE/EtBr}. Преимущество такого способа - буферный раствор легко можно заменить гель-фильтрацией.

По пунктам.

п. 1.

Коротковолновое UV- облучение (254nm) может очень сильно понизить эффективность трансформации (365nm облучение сказывается слабо). "Вредоносность" 254nm облучения зависит от размера pDNA. 1' облучения уменьшает эффективность клонирования pDNA в:

3.2kb	~ 4 раза
4.8kb	~ 30 раз
8.2kb	~ 500 раз

Если лунки достаточно близко друг к другу, нужно быть очень внимательным, чтобы не устроить разрез между ними.
лишние куски агарозы легче всего убрать с помощью обрезанного желтого типчика, подсоединенного к вакуумному насосу. Если лунки небольшого размера, то вырезать их проще всего стеклянной Пастеркой, подсоединённой к вакуумному насосу. Чтобы легко видеть конец Пастерки под ультрафиолетовой лампой можно вначале "всосать" в неё немного краски с обычного лабораторного маркера.

п. 4.

Электрофорез при высокой напряженности поля выравнивает скорости движения молекул DNA разного размера.
За продвижением полосы DNA удобнее следить, если фон под камерой темный.

п. 5.

Если использовать для электрофореза буфер TAE, выделенную ДНК без дальнейшей очистки можно использовать для лигирования, кинирования, реакции Random Primer. Примесь PEG не ингибирует рестрикцию.
Примесь PEG мешает анализу выделенного фрагмента с помощью электрофореза, вызывая размытие полосы при переходе DNA из лунки в гель. Чтобы получить четкие полосы, нужно перед нанесением экстрагировать раствор DNA равным объёмом водонасыщенного X:I (24:1).

п. 8, 9.

Центрифугирование выполняется в два этапа, т.к. PEG образует весьма плотную подушку, которая способна увлечь DNA в интерфазу.

> Методы > Выделение ДНК из агарозного геля > С помощью PEG/TAE. Выделение ДНК из агарозного геля с помощью PEG/TAE.		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
Растворы. PEG/TAE Комментарии. Общие. По пунктам.	На наш взгляд это самый удобный метод выделения DNA из геля. Он дёшев, позволяет выделить фрагменты DNA любого размера с эффективностью более 90%, очень быстр, позволяет выделить одновременно так много фрагментов, как много лунок Вы вырежете.
вырезать лунку перед полосой (под длинноволновым 365nm UV), убрать лишние куски агарозы; убрать из камеры лишний буфер (может быть придётся наложить фитили из фильтровальной бумаги (см. рис.)); заполнить лунку PEG/TAE; вогнать DNA в лунку 20-25v/cm, за продвижением полосы DNA следить с помощью UV лампы (360nm); собрать раствор из лунки (хранить при -20^oС); хороший тон - сфотографировать после этого гель под UV. обычно дальнейшая очистка не требуется, для каких то "особо чистых" случаев: экстрагировать Ф:Х:I; ЦФ 2-3 krpm NT, 5'; ЦФ NT, 5'; экстрагировать Х:I; ЦФ NT, 5'; добавить 1/10V 3M AcONa, 2хV EtOH, смешать; осадить, сполоснуть 70% EtOH, растворить в воде или TE.