Выделение ДНК из агарозного геля с помощью LMP-агарозы | Практическая молекулярная биология

Комментарии.

По пунктам.

п. 1.

Гели из LMP-агарозы имеют меньшую разрешающую способность, чем гели из нормальной агарозы. К тому же LMP агароза существенно дороже. Обе эти причины часто делают второй способ более предпочтительным. Мы храним 0.5% LMP/1xTAE/EtBr на 4^oC в 50ml пробирке, а перед применением плавим ее на кипящей бане.
Коротковолновое UV- облучение (254nm) может очень сильно понизить эффективность трансформации (365nm облучение сказывается слабо). "Вредоносность" 254nm облучения зависит от размера pDNA. 1' облучения уменьшает эффективность клонирования pDNA в:

п. 2.

п. 4.

Если концентрация соли низкая, то DNA может уходить из водной фазы при экстракции фенолом.

п. 5.

-70^oС, 5';
ЦФ.

п. 6.

п. 8, 9.

Центрифугирование выполняется в два этапа, т.к. агароза образует весьма плотную подушку, которая способна увлечь DNA в интерфазу.

> Методы > Выделение ДНК из агарозного геля > С помощью LMP-агарозы. Выделение ДНК из агарозного геля с помощью LMP-агарозы.		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
Комментарии. По пунктам.	Метод позволяет выделять фрагменты ~0.2-15kbp с эффективностью ~80%.
либо залить полностью LMP- гель, либо вырезать лунку перед нужной полосой (под длинноволновым UV 365nm), заполнить её LMP/1xTAE и вогнать полосу в LMP; вырезать нужный кусок геля, взвесить; + TE, чтобы финальный % агарозы стал <0.5%; довести NaCl до 0.1M; 67^oC, 10' время от времени перемешивая; охладить до NT; экстрагировать Ф (встряхивать 1-3'); ЦФ 1.6kg (~4-5krpm), NT, 3'; ЦФ NT, 5'; экстрагировать Ф:Х, Х; добавить 1/4V 10M AcONH₄, 2V EtOH, осадить; сполоснуть 70% EtOH; растворить в воде или TE.