Другие методы осаждения ДНК(РНК) - PEG, Zn, CTAB. | Практическая молекулярная биология

Осаждение ДНК PEG.

Удобный метод для переосаждения DNA после расщепления RNase.

оптимальные условия:

PEG => 13%
MgCl₂ => 10mM

10' NT;
ЦФ 10' NT.

Выход

~0.1 µg/ml => ~70%
>1 µg/ml => ~95-100%

Можно использовать вариант осаждения (5%PEG, 0.6M NaCl – конечные концентрации).
Эффективно осаждаются только >150bp фрагменты.
От PEG можно отмыться 2х70% EtOH.

Осаждение ДНК Zn.

убедиться, что образец:

* содержит по крайней мере 5mM Tris (Cl, Borat, Acetate), pH7.0-8.5,
* и не содержит >0.1mM EDTA;

+ NaP до 0.1-1.0mM фосфата;
+ 0.1M ZnCl₂

для V<500 µl -> 1/20,
для V>500 µl -> 1/100;

смешать, 15' NT;
ЦФ 5';
ресуспензировать осадок в буфере с минимум 1mM EDTA (pH не больше 8.0).

При таком осаждении осаждается всё: DNA, RNA, белки, бактерии.
Осаждение плазмидной DNA: от 0.1 µg/ml; олигонуклеотидов (20b) от 10 µg/ml.

Осаждение CTAB.

DNA + CTAB (из 5% стока) до 0.25-1.4%;
2'-ON NT;
ЦФ 10'.
растворить в буфере с высокой ионной силой, переосадить спиртом.

CTAB (Cetrimide CH₃(CH₂)₁₅N(CH₃)₃Br, Mw=364.5)

CTAB – сильный детергент. Он эффективно разрушает ДНК - белковые комплексы. Комплекс нуклеиновых кислот с CTAB растворим только в высокой соли (2M LiCl, 1M NaCl). Для очистки нуклеиновых кислот раствор нуклеиновых кислот в 1.5M NaCl, 2% CTAB можно экстрагировать хлороформом. CTAB образует нерастворимый комплекс с DNA при концентрации соли ниже, чем 0.5M (выпадает в осадок при добавлении 2-2.5V EtOH или 0.7V изопропанола). Полисахариды, мембраны, фенолы и т. п. при этом не осаждаются. После осаждения, для очистки от остатков CTAB требуется переосаждение, осадок лучше сполоснуть 80% спиртом (CTAB в нём растворим).

> Методы > Клонирование > Преципитация нукл. кислот PEG, Zn, CTAB. Другие методы осаждения ДНК(РНК) – PEG, Zn, CTAB.		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
Осаждение ДНК PEG. Осаждение ДНК Zn. Осаждение ДНК CTAB.
Осаждение ДНК PEG. Удобный метод для переосаждения DNA после расщепления RNase. оптимальные условия: PEG => 13% MgCl₂ => 10mM 10' NT; ЦФ 10' NT. Выход ~0.1 µg/ml => ~70% >1 µg/ml => ~95-100% Можно использовать вариант осаждения (5%PEG, 0.6M NaCl – конечные концентрации). Эффективно осаждаются только >150bp фрагменты. От PEG можно отмыться 2х70% EtOH. Осаждение ДНК Zn. убедиться, что образец: * содержит по крайней мере 5mM Tris (Cl, Borat, Acetate), pH7.0-8.5, * и не содержит >0.1mM EDTA; + NaP до 0.1-1.0mM фосфата; + 0.1M ZnCl₂ для V<500 µl -> 1/20, для V>500 µl -> 1/100; смешать, 15' NT; ЦФ 5'; ресуспензировать осадок в буфере с минимум 1mM EDTA (pH не больше 8.0). При таком осаждении осаждается всё: DNA, RNA, белки, бактерии. Осаждение плазмидной DNA: от 0.1 µg/ml; олигонуклеотидов (20b) от 10 µg/ml. Осаждение CTAB. DNA + CTAB (из 5% стока) до 0.25-1.4%; 2'-ON NT; ЦФ 10'. растворить в буфере с высокой ионной силой, переосадить спиртом. CTAB (Cetrimide CH₃(CH₂)₁₅N(CH₃)₃Br, Mw=364.5) CTAB – сильный детергент. Он эффективно разрушает ДНК - белковые комплексы. Комплекс нуклеиновых кислот с CTAB растворим только в высокой соли (2M LiCl, 1M NaCl). Для очистки нуклеиновых кислот раствор нуклеиновых кислот в 1.5M NaCl, 2% CTAB можно экстрагировать хлороформом. CTAB образует нерастворимый комплекс с DNA при концентрации соли ниже, чем 0.5M (выпадает в осадок при добавлении 2-2.5V EtOH или 0.7V изопропанола). Полисахариды, мембраны, фенолы и т. п. при этом не осаждаются. После осаждения, для очистки от остатков CTAB требуется переосаждение, осадок лучше сполоснуть 80% спиртом (CTAB в нём растворим).