Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Клонирование > Мутагенез.

Мутагенез с помощью Gene Editor system.


Главная.
Новости.
О проекте.
Справочник.
Рестриктазы.
Методы.
Растворы.
Расчёты.
Обзоры.
Обучение.
Ссылки.
Скачать сайт.

Образовательные
ресурсы.

5'- фосфорилирование олигонуклеотидов.
Щелочная денатурация dsDNA.
Щелочная денатурация без переосаждения.
Отжиг.
Синтез мутантной цепи.
Трансформация бактерий.
Растворы.
ATP, 10mM
Буфер для отжига 10х
Буфер для синтеза 10х
SOC
Смесь антибиотиков GE (50x).
NaOH/EDTA
Комментарии.
Общие.

    5'- фосфорилирование олигонуклеотидов.

  1. собрать смесь:  
    2. олигонуклеотид 100pmol 40pmol 20pmol
    10x киназ. буфер 2.5µl 1.0µl 0.5µl
    T4 PNK 5u 2u 1u
    ATP, 10mM 2.5µl 1.0µl 0.5µl
    H2O / до 25µl / до 10µl / до 5µl
  2. 37oC, 30';
  3. 70oC, 10' - инактивировать PNK;
  4. развести мутагенизирующий олигонуклеотид:

    5. 2µl+4.4µl(H2O)=>6.4µl (1.25pmol/µl),

  5. олигонуклеотид селекции:

    6. 2µl+30µl (H2O)=>32µl (0.25pmol/µl);

  6. хранить при -20oС;
  7. денатурировать матрицу:

    8. Щелочная денатурация dsDNA.

    7a1. денатурировать ~0.25pmol (~1µg) dsDNA, добавив:

    2M NaOH 1µl,
    EDTA до 2mM,
    H2O до финального V=9µl;

    7b1. 10' NT
    7c1. добавить

    2M NH4Ac (pH 4.6) 1µl,
    100% EtOH 38 µl;

    7d1. -70oC, 30';
    7e1. ЦФ;
    7f1. 70% EtOH;
    7g1. растворить в 50µl TE7.5, 10µl => анализ (форез);

    Щелочная денатурация без переосаждения.

    7a2. собрать смесь:

    pDNA 1µg
    NaOH (1N)1µl
    H2O/ до 2µl

    7b2. 10' NT;
    7c2. добавить

    1N HCl 1µl,
    TE7.5 44µl

    Отжиг.

  8. собрать смесь:

    9. DNA матрица (~0.05pmol) => 10µl (если из п.12а. (8б.))
    олигонуклеотид селекции (0.25 pmol/µl) => 1.0µl
    мутагенизирующий олигонуклеотид (1.25 pmol/µl) => 1.0µl
    буфер для отжига 10х => 2.0µl
    H2O до => 20µl

  9. 75oC, 5';
  10. медленно (0.5oС за 20'' в PCR приборе или в 200ml водяной бане) охладить до 37oС;

    11. Синтез мутантной цепи.

  11. прямо на 37oС добавить (до суммарногоv=30µl):

    12. H2O => 5µl
    буфер для синтеза 10x => 3µl
    T4 DNA pol. => 1µl (5-10u)
    T4 DNA lig. => 1µl (1-3u);

  12. 37oC, 1.5h.

    13. Трансформация бактерий.

  13. трансформировать BMH 71-18mutS клетки 1.5µl мутагенизированной реакции;
  14. вместо высева + 4ml LB (c 100µl GE антибиотика, 10µl Amp), качать 37oC 16-18h;
  15. очистить pDNA, оценить концентрацию;
  16. трансформировать "нормальные клетки" ~10ng pDNA;
  17. 1/5 высеять на чашку (20ml LB agar + 20µl Amp + 150µl GE антибиотика);

    Растворы.

    ATP, 10mM

    (хранить смесь при -200С).

    Конц.Сток50µl
    ATP10mM100mM5µl
    H2O mQ45µl

    Буфер для отжига 10х

    (хранить при -200С долговременно, при +40C в течение дня).

    Конц.Сток1ml
    TrisCl(pH *)0.2M1M0.2ml
    MgCl20.1M1M0.1ml
    NaCl0.5M5M0.1ml
    H2O mQ0.6ml

    * pH 7.5 при 370C (то же, что и рН 7.8 при 250С)

    Буфер для синтеза 10х

    (хранить при -200С)

    Конц.Сток200µl
    TrisCl (pH 7.5)0.1M1M20µl
    dNTP’s (mix)5mM100mM10µl
    ATP10mM100mM20µl
    DTT80mM1M4µl
    H2O mQ146µl

    SOC

    (хранить при NT).

    Сток200ml400ml
    Bactotriptoneтв.4.0g8.0g
    Bacto Yest extr.тв.1.1g2.2g
    NaCl5M0.4ml0.8ml
    KCl1M2.0ml4ml
    H2OmQ~196ml~391ml
    1. автоклавировать, охладить до <60oС;
    2. добавить:

      3. 0.01V 2M Mg2+{= 1M MgCl2 + 1M MgSO4}  
      0.01V 2M glucose  ;

    3. фильтровать через 0.2µm фильтр;
    4. аликвотить, хранить при -20oC, (-70oC).

    Смесь антибиотиков GE (50x).

    Конц.40ml
    cefotaxime 25µg/ml25µg/ml1mg
    ceftriaxone 25µg/ml25µg/ml1mg
    KPO4(pH 6.0) 0.1M 40ml

    * Стерилизовать фильтрованием или готовить на стерильной KPO4из стерильного порошка.
    * Хранить при -200С, min количество циклов замораживания-оттаивания.

    NaOH/EDTA

    Конц.Сток1ml
    NaOH2M10M200µl
    EDTA2mM0.5M4µl
    H2O mQ796µl


    Комментарии.

    Общие.

  • Мы пытались приготовить компетентные клетки используя ТВ (Okajama), но получил компетентность лишь ~2x106. Электрокомпетентные клетки получились с компетентностью ~7x108.
  • Вполне возможно, что в этап денатурации неплохо будет ввести 30' обработку слабой DNase на 37oС (так, чтобы <1 разрыва на молекулу). Последующие разбавление, снижение температуры, 75oС - вполне могут ее инактивировать.
  • Мы пытались растить pSKII(-) и pSKII(-)ge на различных концентрациях GE-antibiotic mix:
    • GE-antibiotic mix на 5ml среды400µl200µl100µl (как в протоколе)50µl25µl10µl5µl
    pSKII(-)ge (8h;ON)+;++;++;++;++;++;++;+
    pSKII(-)(8h;ON)-;--;--;--;--;-+/-;-+;+
    pEM/7Z (8h;ON)-;--;--;--;--;--;-+;+

    Получается, что используемая для селекции концентрация в ~10 раз превышает предельную, но более, чем в 4 раза меньше, чем ингибирующая для Amp(ge)-гена.

  • При концентрациях, которые ингибируют рост бактерий, вначале кажется, что бактерии растут, но после ON среда оказывается прозрачной.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100

Hosted by uCoz