Влияние различных веществ на PCR.

Вещества, улучшающие специфичность (и/или) выход PCR реакции.

• Важно отметить, что добавление этих веществ к уже оптимизированной и хорошо идущей реакции может вызвать ухудшение выхода. Это не удивительно - указанные вещества изменяют взаимодействие между праймерами и матрицей и между матрицей и полимеразой, и в случае хорошей реакции эти изменения скорее всего дадут отрицательный эффект.

Вещество:     Сток:    Используемые концентрации: Механизм действия: Acetamide 25% ~5% повышение растворимости Betain Na 5M 0.5-2M (оптимально ~1.6M) стабилизация фермента, понижение Tm DNA, выравнивание Tm AT- и GC-богатых последовательностей BSA 10 µg/ µl ~0.1 µg/ml стабилизация фермента DMSO 100% 2.0-15% (оптимально ~5%) повышение растворимости Formamid 100% 1-5%   Glycerol 100% 5-20% (оптимально10-15%) стабилизация фермента NP-40, Tween 20, Triton X-100 10% 0.1-0.5% (улучшает seq. PCR) стабилизация фермента PEG 8000 40% 5-20% (оптимально - 15%) повышение эффективной концентрации Tetramethylammonium chloride (TMA chloride) 5M 0.01-0.1mM повышение специфичности Pyrophosphatase thermostable 5 u/µl 0.001-1u/реакцию устранение пирофосфатов, которые могут обращать реакцию полимеризации ssDNA binding protein E.coli 500 µg/ml 5 µg/ml стабилизацияssDNA ssDNA binding protein T4 gene 32 protein 500 µg/ml улучшает выход в концентрациях 0.5-1.0mM. стабилизация ssDNA

• Из статьи "Kovarova M., Draber P. New specificity and yield enhancer of polymerase chain reactions. Nucleic Acids Res 2000 Jul 1;28(13):E70" В скобках – концентрация веществ, приводящая к указанному эффекту. Число перед скобками означает относительную эффективность действия. Специфичность оценивается как доля DNA, приходящаяся на специфическую полосу.
• TMA производные практически не изменяли оптимальную температуру отжига.

Вещество Максимальная 90% ингибирование эффективность специфичность TMA chloride 1.9(5 mM) 0.5(20 mM) (35 mM) TMA oxalate 2.2(2 mM) 1.0(2 mM) (9 mM) TMA acetate 1.0(<10 mM) 0.4(20 mM) (40 mM) TMA hydrogen sulfate 1.2(0.5 mM) 1.0(50 mM) (70 mM) Ammonium chloride 1.0(<20 mM) 0.2(<20 mM) (50 mM) Benzyldimethylhexadecylammonium chloride 1.1(0.2 mM) 0.4(1 mM) (1.0 mM) HTA bromide 1.2(0.05 mM) 0.5(0.5 mM) (0.8 mM) HTA oxalate 1.0(<0.2 mM) 0.28(<0.2 mM) (0.5 mM) Betaine monohydrate 1.1(100 mM) 0.4(750 mM) (900 mM) Dimethyl sulfoxide 1.0(<1.4 M) 0.6(1.4 M) (1.6 M) Formamide 1.4(0.5 M) 0.8(1 M) (2.0 M) PCR без добавок 1.0 0.2

Детергенты.

Неионные   NP-40 >5% v/v Tween-20 >5% v/v TritonX-100 >5% v/v N-octylglucoside <0.4% w/v Ионные отрицательный эффект до некоторой степени может быть скомпенсирован добавлением неионных детергентов SDS <0.01% w/v; 0.005% w/v снижает выход ~ в 2 раза; Na desoxycholate <0.06% w/v N-Lauroylsarcosine Na <0.02% w/v

Другие вещества.

Агароза не мешает до ~1%. АА акриламид линейный не мешает (по крайней мере в низкой концентрации). AcONa (pH 5.0) начинает ингибировать при>5mM. BSA ацетилированный 10µg/ml - ингибирует. BSA heat инактивированный 10µg/ml - не мешает. Vanadil ribonucleoprotein complexes ингибируют при > 0.4mM; не мешают при <0.04mM (когда цвет 8-гидроксихинолина в феноле не изменяется при экстракции - уже не ингибируют) Гемоглобин (концентрация в крови ~160mg/ml) уменьшает выход при >1mg/ml. Гепарин ингибирует (используется для предотвращения свертывания крови 14.3 u/ml, не устраняется органическими растворителями и переосаждением). Ингибирует PCR при >0.15U/ml. EDTA связывается с Mg2+ стехиометрически, начинает ингибировать при >0.5mM, PCR не идёт при 1mM. DEPC ингибирует реакцию, лучше не использовать в PCR-реакции растворы, обработанные DEPC. Желатин 10µg/ml - не мешает. Изопропанол ингибирование при концентрациях >1% (более сильный ингибитор, чем этанол). Масло, покрывающее PCR может устранять ингибирующий эффект некоторых загрязнений. Мочевина (в моче ~350mM) на разные реакции - по разному, в среднем, начинает ингибировать при >20mM. NaCl заметно ингибирует при 25mM, PCR не идёт при 50mM. RT смесь не влияет на PCR реакцию при концентрации 10%, начинает ингибировать при >15%. RNA ингибируют (>0.5µg на 20µl PCR); ингибирующий эффект можно устранить добавлением в реакцию RNase (термостабильна). Сахароза не мешает до 30%. Фенол уменьшает выход при >0.2%, PCR не идёт при 0.5%. Ficoll 400 не мешает до 1% (выше - ингибирует). HxPO4 Mg3(PO4)2 - образует преципитат при NT, если >0.25mM (в PBS - HxPO4~9.3mM). Этанол для некоторых реакций - стимулирующий эффект при 1%, для других - ингибирование при концентрациях >1%. Хлороформ не влияет на PCR реакцию даже при концентрации 5%. Цитрат Na не оказывает влияния при 1mM. Меланин Заметно от 0.01µg/µl, ингибирует: 0.08µg/µl. Polyvinilpyrollidon (PVP) не ингибирует по крайней мере до 2% Мембраны: Nitrocellulose ингибирует PCR Cellulose acetate ингибируетPCR Fluropore не ингибирует PCR Durapore не ингибирует PCR

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru