Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Сиквенс > Ферментативная реакция.

Cиквенсовая реакция.


Главная.
Новости.
О проекте.
Справочник.
Рестриктазы.
Методы.
Растворы.
Расчёты.
Обзоры.
Обучение.
Ссылки.
Скачать сайт.

Образовательные
ресурсы.

ssDNA.
Отжиг.
Реакция.
dsDNA.
Щелочная денатурация.
Непроверенная информация Тепловая денатурация.
Растворы.
Primer/NaOH
Нейтрализующий раствор
NSA
STOP
Комментарии.
По пунктам.

    Для ssDNA.

    Отжиг.

  1. приготовить смесь:
    2. H2O до суммарного V => 5µl,
    5x буфер 1µl
    Primer 0.5µl (0.5pmol/µl)
    ss DNA ?[µg] => 0.16 x размер[kbp]
  2. 2' на температуре > 65oC, медленно остудить до <35oC (15-30'), сразу в лед;

    3. Реакция.

  3. раскапать терминирующие смеси по 1.25µl, NT;
  4. приготовить разбавленный Lab. mix -> в лед;   
    5. Кол-во реакций 1 x 3.3 x 5.5 x 6.5 x 15.5
    DTT 0.5µl 1.7 2.8 3.25 7.75
    Lab.mix 0.2µl 0.7 1.1 1.3 3.1
    H2O 0.8µl 2.6 4.4 5.2 12.4
    a[33P]dATP 0.25µl 0.8 1.4 1.6 3.9
    Seq/Taq pol. 1µl 3.3 5.5 6.5 15.5
  5. к смеси отжига добавить разбавленный Lab. mix по 2.75µl;
  6. NT(~18oC), 2-5';
  7. во время мечения поставить пробирки с терминирующими смесями в ЦФ; за 30'' до конца мечения открыть крышки;
  8. по 1.8µl в терминирующие пробирки ;
  9. 37oC, 5';
  10. 70oC, 10';
  11. 0oС, ~2';
  12. + 2µl "Stop".
  13. 0oС;
  14. непосредственно перед нанесением на гель: 80oС, 2', затем сразу в лед ~ 2'.

    15. Для dsDNA.

    На наш взгляд более удобен метод щелочной денатурации.

  15. приготовить смесь:

    16. pDNA 3.25µl => (0.5-1µg),
    Primer/NaOH => 0.75µl;

  16. 37oC 10';
  17. + 1µl нейтрализующего раствора;
  18. сравнить цвет с серией стандартов: нужно, чтобы pH был в районе 7.0-8.0, для коррекции добавлять по 0.1µl 0.1M NaOH (или HCl);
  19. 37oC 5';
  20. далее, начиная с п. 3 для ssDNA.

    21. Альтернативный метод – тепловая денатурация.

    Сообщалось, что если проводить денатурацию в присутствии буфера, то получится высокий фон и шмер; если добавлять буфер после денатурации, то все нормально (на наш взгляд, очень странно):

  21. приготовить смесь:

    22. pDNA 3.5µl (0.5-1µg),
    Primer (0.5pmol/µl) 0.5µl;

  22. 97oC, 5';
  23. ЦФ, NT;
  24. + 1µl 5x Seq. Buf.;
  25. отжиг 15' 37oC;
  26. далее, начиная с п. 3 для ssDNA.

    Растворы.

    Primer/NaOH

    6.6x (хранить при -20oС)

    Конц.Сток3µl50µl
    Primer1.33µM2pmol/µl2µl33.3µl
    NaOH0.33N1N1µl16.7µl

    Нейтрализующий раствор

    5x (хранить при -20oС)

    Конц.Сток4µl50µl
    Cresol Red0.25mM1mM1µl12.5µl
    NSA5x10x2µl25µl
    HCl0.25N1N1µl12.5µl

    NSA

    Non Salt Annealing buffer, 10x

    Конц.Сток1ml
    TrisCl (pH 7.5)0.4M1M400µl
    MgCl20.2M1M200µl
    H2O mQ400µl
    Буфер для нанесения, Конц. Сток 1ml 960ml 40ml 0.05% 0.5mg тв. 0.5mg

    STOP

    Буфер для нанесения

    Конц.Сток1ml
    Формамид96%100%960µl
    EDTA20mM0.5M40µl
    Бромф. синий0.05%тв.0.5mg
    Ксилен-цианол0.05%тв.0.5mg


    Комментарии.

    По пунктам.

    п. 2.

  • Нормальный темп охлаждения - если используется 0.5L стакан со 100ml H2O.

    • п. 3.

  • Если матриц для сиквенса не слишком много (~10-15), удобно подписывать терминирующие пробирки во время отжига. Если их больше - лучше сделать это заранее.
  • Мы предпочитаем подписывать пробирки для отжига и терминирующие пробирки циклически, чередуя фломастеры 4х различных цветов (каждая матрица/ терминирующая пробирка имеет свой соответствующий цвет, чтобы не запутаться при манипуляциях).

    • п. 4.

  • a[33P]dATP - от 0.25µl до 0.5µl в зависимости от свежести метки.
  • Мы используем смесь Sequenase*:Tag pol.=20u:1u (*разведённая в глицерол-содержащем буфере). Tag pol. работает в п. 10; её функция – продолжить места неспецифической остановки Sequenase. Такая модификация протокола весьма проста, но даёт очень хорошие результаты – мы практически никогда не сталкиваемся со "strong stop’s".

    • п. 14.

  • Сообщалось, что добавление DMSO до 10% на этапах мечения и терминации или Formamide 10% на этапе отжига, способны существенно улучшить сиквенсовую картинку (Sequenase спокойно выдерживает присутствие 10% formamide).
  • Образцы c 35S и 33P могут храниться неделю при -20°C. Образцы с 32P должны быть разогнаны на форезе в тот же день.

    • п. 15.

  • Внимание! При приготовлении ds pDNA для сиквенса endA+ штаммы дают никованную DNA, которая приводит к появлению "фоновых полос" на сиквенсовом геле. Лучше использовать endA- штаммы типа DH5a, SURE, JM109, JM105.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100

Hosted by uCoz