Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > Сиквенс > Сиквенсовый гель и форез.

Приготовление сиквенсового геля и форез.


Главная.
Новости.
О проекте.
Справочник.
Рестриктазы.
Методы.
Растворы.
Расчёты.
Обзоры.
Обучение.
Ссылки.
Скачать сайт.

Образовательные
ресурсы.

Подготовка стёкол.
Гель будет сушиться на стекле.
гель будет сушиться на 3мм.
Приготовление геля.
Заливка.
Форез.
Послефорезная обработка.
Гель на стекле.
Гель на 3ММ.
Автограф.
Растворы.
GTGB

    Подготовка стёкол.

    Гель будет сушиться на стекле.

  1. старый гель снять, вымочив ~0.5h в 0.5N NaOH (или КOH);
  2. мыть порошком (или хромпиком, если пластины давно в использовании, новые или из ненадежных рук);
  3. сполоснуть H2O, дать стечь, подсушить EtOH;
    • т.к. bind-silane очень летучее вещество и даже небольшого его количества достаточно, чтобы приклеить гель к стеклу, то:

      • * вначале обработать "неудобную" пластину (например, пластину "с ушами") repel-silane, затем "удобную" - bind-silane,
      * следить, чтобы перчатки и бумага, соприкасавшиеся с bind-silane не дотрагивались до repel-пластины,
      * сэндвич из пластин собирать непосредственно перед заливкой.

    • мы используем для полировки 1/4 листа А4 хорошей писчей бумаги. Ее нужно резать ножницами, а не рвать, чтобы не появлялось ворсинок.

    Для пластин размером 50x20сm2:

    Repel-silane.

  1. распределить по поверхности 5ml Repel silane, подсушить, отполировать;
  2. повторить п. 4;
  3. сполоснуть EtOH;
  4. подсушить, отполировать.

    5. Bind-silane.

  5. равномерно распределить по поверхности 5ml смеси:  

    6. EtOH => 5ml,  
    уксусная кислота => 125µl,  
    Bind-silane => 19µl;  

  6. подсушить, отполировать;
  7. сполоснуть EtOH;
  8. подсушить, отполировать.

    9. гель будет сушиться на 3мм.

  9. мыть порошком (или, если пластины давно в использовании, новая или из ненадежных рук - хромпиком);
  10. сполоснуть H2O, дать стечь, подсушить EtOH;
  11. "неудобную" пластину обработать Repel-silane; "удобную" - не трогать.

    12. Приготовление геля.

    • Лучше не пользоваться готовыми растворами т.к. в твердом виде отдельные компоненты лучше хранятся.
    • Даже жидкости удобнее фасовать на весах.
    • Твердые вещества взвешивать в одну и ту же кювету (начинать с маленьких количеств, заканчивать большими: BIS->AA->Urea.)
    • Мы используем гель с формамидом только для сиквенса проблемных областей (в сочетании с 7-deaza dGTP), так как на геле без формамида полосы чётче и его удаётся читать дальше).
  12. гель (5%) с формамидом:
    13. 50ml 100ml 70ml 80ml
    Мочевина 21g 42g 29.4g 33.6g
    Акриламид 2.38g 4.75g 3.33g 3.8g
    ВIS-АА 0.13g 0.25g 0.18g 0.2g
    Формамид 17.5ml
    19.78g    		 35ml
    39.55g    		 24.5ml
    27.69g    		 28.0ml
    31.64g
    H2O 12.3ml 24.6ml 17.22ml 19.68ml
    Ионообменная смола* ~2.5g ~5g ~3.5g ~4g

    (5%)без формамида:

      50ml 100ml 70ml 80ml
    Мочевина 21g 42g 29.4g 33.6g
    Акриламид 2.38g 4.75g 3.33g 3.8g
    ВIS-АА 0.13g 0.25g 0.18g 0.2g
    H2O 29.8ml 59.6ml 41.72ml 47.68ml
    Ионообменная смола* ~2.5g ~5g ~3.5g ~4g

    * обычно необязательно.

  13. деионизовать (обычно необязательно): перемешивать 0.5h; отфильтровывать через 0.45µm фильтр;
  14. добавить:
    15. GTGB 20x 2.5ml 5.0ml 3.5ml 4.0ml
  15. дегазировать: >15' - без встряхивания, >10' - со встряхиванием.
  16. добавить в указанном порядке непосредственно перед заливкой геля:
    17. PSA 10% свежий 250µl 500µl 350µl 400µl
    TEMED 25µl 50µl 35µl 40µl
    • Растворение мочевины - эндотермическая реакция. Чтобы она шла быстрее - лучше раствор подогревать (можно использовать Microwave), но не нагревать выше 30-35oС, иначе при дегазировании раствор будет кипеть слишком бурно.
    • Если PSA добавляется твердым, во избежании образования маленьких сгустков геля нужно растворить его вместе с мочевиной и только затем добавлять АА и BIS-AA.
      Если раствор геля будет использован сразу после приготовления - PSA можно добавлять заранее.

    Объемы геля.

    пластина: Vготовить Vрасходуется
    50x20 см2 50ml ~35ml

    Заливка.

  17. если имеются только ровные спейсеры, а нужны клинообразные - подклеить 5 слоев paper tape (уменьшающейся длины) или два куска спейсера (для 50cm пластин ~10cm и ~5cm);
    18. Изготовление клинообразных спейсеров
  18. заклеить 3 стороны непрерывным куском "yellow tape";
  19. зажать стекла бульдогами (верхнюю часть зажимать не надо, иначе гребенка не влезет);

    20. клинообразный гель
    (самодельные спейсеры):    		клинообразный (фабричные спейсеры)
    или плоский гель:

    Расположение бульдогов на стеклах

  20. залить гель 50ml пластиковым шприцом. (после использования сполоснуть шприц водопроводной водой и дистиллятом. Не мыть детергентами (!) так как смывается смазка с поршня);
  21. вставить гребенку, зажать ее бульдогами;
  22. полимеризация >1h (оптимальная температура полимеризации ~23-25oС. В оптимальном случае гель застывает за 8-10'. Удобно отлить из остатков гелевого раствора ~0.5 -1.0ml в 1.7ml пробирку и использовать ее как индикатор полимеризации. Если важна воспроизводимость, лучше выдержать гель 2h при NT;
  23. гель можно хранить несколько суток при 4oС. Для этого на стеклянный карман нужно положить фильтровалку, смоченную буфером и плотно замотать верхнюю часть Saran wrap.

    24. Форез.

  24. немедленно после извлечения гребенки сполоснуть карман (5ml шприцем);
    • Гребёнку "акульи зубы" лучше вставлять сразу, как только освободится карман. Через некоторое время (возможно из-за разогрева при префорезе) толщина геля может уменьшиться;
    • Опасно на одном и том же геле делать два прогона, т.к. через 1-2h фореза гель может слегка отслоиться в верхней части;
  25. префорез ~15';
    • Оптимальная температура фореза ~55oС;
    • Мощность для 50х20cm2 геля (клинообразный: 0.4-0.6mm) ~75 W.
    • Наносить на гель образцы (естественно, все четыре буквы - рядом) лучше блоками "через один". Например, сначала нанести все нечётные матрицы и вогнать их в гель приблизительно на 3-5mm, а затем нанести чётные. При этом между блоками появляется небольшой зазор, который облегчает чтение геля.
    • На "первый" прогон лучше использовать клинообразные спейсеры, на "второй" - только плоские(!) (использование на "втором" прогоне клинообразных пластин практически не улучшит равномерность расстояния между полосами геля, но зато приведёт к весьма ощутимому уменьшению "эффективной длины " геля, в результате с геля можно будет прочитать заметно меньше полос).

    Подвижность красителей в PAAG (денатурирующий):

    % АА Бромфеноловый синий [bp] Ксилен. цианол. [bp]
    5% 35 130
    6% 26 106
    7% 22 88
    8% 19 70-80
    10% 12 55
    20% 8 28

    Послефорезная обработка.

  26. фиксировать до практической отмывки красителей (можно оставить ON) в растворе:

    27. 10% уксусная к-та,
    10% EtOH;

    толщина геля: время фиксации:
    0.2mm ~5'
    0.4mm ~15'
    0.4-1.2mm ~60'

    Гель на стекле.

  27. вытащить из фиксирующего раствора,
  28. 1 раз промакнуть фильтровалкой;
  29. сушить феном;

    30. Гель на 3ММ.

  30. наклонить гель;
  31. дать стечь лишней жидкости;
  32. перенести гель на 3ММ;
  33. сушить - на гель-драере (чем лучше насос, тем выше может быть температура сушки без опасности, что гель растрескается);

    34. Автограф.

  34. лучше при -70oС. Либо экспонировать через saran-wrap, либо перед закладкой плёнки посыпать гель тальком.

    Растворы.

    GTGB

    20x /Glycerol tolerant gel buffer/ (хранить+4oС):

    Конц.Сток1L1.5L2.0L2.5L

    Tris base

    		1.78M121.14g/M216g324g432g540g

    Taurine

    		0.56M125.15g/M72g108g144g180g

    Na2EDTAx2H2O

    		10.7mM372.3 g/M4g6g8g10g

    H2O

    		 mQ802ml1203ml1604ml2005ml

    p=1.094


"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100

Hosted by uCoz