Выделение RNA из культур клеток | Практическая молекулярная биология

> Методы > РНК > Выделение из культур клеток. Выделение RNA из культур клеток.		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
Растворы. GTB Na citrate Комментарии. Общие. По пунктам.
2х промыть клетки 1xPBS (по ~5ml на чашку d=8cm); добавить GTB (из расчёта 5-8ml на чашку d=8cm); лизировать клетки, покачивая чашку, перенести лизат в пробирку; добавить 1/10V AcONa, 3M pH5.0; смешать (и заодно раздробить DNA) несколько (3-4) раз пропустив лизат через 19G иглу; добавить 1V водонасыщенного (кислого) фенола, смешать; NT, ~5'; добавить 1/5V Х, интенсивно смешать/вортекс (~3-4'); ЦФ~1krpm, NT, 5-10'; ЦФ>4krpm, NT, 10'; перенести водную фазу в пробирку с 1V водонасыщенного фенола, смешать; повторить пп.7,8; ЦФ>4krpm, NT, 10'; экстрагировать хлороформом; добавить 1V изопропанола, смешать; 20^oС, 1h-ON; ЦФ>4krpm, 4^oС, 10-20'; сполоснуть осадок 70% EtOH; растворить в H₂O (RNase free), хранить при -70^oС.

Комментарии.

Общие.

В наших руках с 80mm чашки при 80% плотности получалось от 100 до 300µg тотальной RNA (в зависимости от штамма и состояния клеток).
На 10⁷клеток приходится:

Тип клеток:	total RNA ( µg):	mRNA ( µg)
NIH/3T3 cells	75-200	1.5-4.0
HeLa cells	100-300	2-6
CHO cells	200-400	3-6

По пунктам.

п.1.

Отмывка клеток от ростовой среды.

п. 3.

Гуанидин тиоционат быстро проникает внутрь клеток и инактивирует RNase’s. Нужно убедиться, что лизис полный. Лизат можно хранить сколько угодно времени при -70^oС.

п. 4.

Закисление буфера. Лишь при низком рН экстракция фенолом уводит DNA из водной фазы. Мы не знаем, почему AcNa не включён в буфер GTB, и когда готовим буфер GTB непосредственно перед использованием, мы добавляем туда AcNa сразу.

п. 6.

Нам кажется, что эффективность описываемого метода связана с тем, что при экстракции фенолом получается однофазный раствор. Разделение фаз происходит лишь при добавлении хлороформа.
Экстракция вязкого раствора чревата проблемами, связанными с тем, что DNA захватывает с собой RNA. При пропускании раствора через иглу шприца размер молекул DNA уменьшается до ~50 kbp. На RNA эта процедура не влияет, т.к. её размер практически всегда <20kb.

п.16.

Лучше ON.

п.19.

Мы предпочитаем пользоваться не H₂O^DEPC, а свежей mQ.
Хранение RNA: мы обычно храним RNA в H₂O_mQ, по видимому, грамотнее было бы использовать что-то типа 0.1хTE.
Ещё один способ - растворять RNA в формамиде (растворимость >4mg/ml). Преимущества формамида:

в нём не работает RNase (нет деградации за 30' при NT в 50 µg/ml RNaseA);
можно наносить на форез больший объём образца;
RNA можно хранить и при -20^oС.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru