весы - с точностью не ниже 0.01g;
этанол - в промывалке;
2-3 чашки Петри для промывки;
20-50ml шприц и к нему обрезанные (чтобы можно было надеть на шприц) 200 µl типчики для промывки кишок;
салфетки (удобнее, если разрезанные на небольшие кусочки);
запас жидкого азота для хранения органов;
подписанные (по названиям органов) 50 ml пробирки с проколотыми дном и крышками (чтобы не взорвались) в жидком азоте;
лёд.
Умерщвление мышки.
Разрыв шейных позвонков.
- поместить мышку на сетку, как показано на рисунке, удерживая за хвост;
- потянуть за хвост (не слишком сильно) - мышь, сопротивляясь, будет тянуться вперёд, держась за прутья - это исходное положение, дальше желательно работать уверенно и быстро;
- большим пинцетом или ножницами прижать (достаточно плотно, чтобы не вывернулась) голову мыши (сразу за затылком) к сетке;
- потянуть за хвост одновременно поднимая мышь до угла ~90o (вы должны почувствовать разрыв позвонков).
Газовая камера.
- собрать "газовую камеру";
- накрыть крышкой, дать постоять ~5';
- мышку положить на поднос, закрыть крышку;
- через ~2' - все готово.
Предварительный осмотр.
- определить, самец это или самка;
- состояние шерсти - должна быть чистой и ровной (это критерий нормального самочувствия);
- нет ли дегидратации (защемлённая кожа должна быстро возвращаться на место);
Препарирование.
- намочить шерсть этанолом (чтобы она не лезла внутрь и ради дезинфекции);
- зафиксировать мышку на столике брюшком кверху (проткнув кнопками лапки);
- сделать три разреза кожи брюшка (но не брюшной стенки!):
(1) начало - антериор по отношению к мочевому отверстию, конец - под подбородком;
(2) и (3) начало - там же, где начало первого разреза, конец - у колен;
- раскрыть кожу, зафиксировать;
- если нужны - отделить (prepuital glands) /Pg/;
- отделить доступную часть (L1-L5) лимфатических узлов (lymph nodes) /Ln/;
- отделить слюнные железы (salivary glands) /Sg/
;
Расположение лимфатических узлов.
| | Название узла | Название узла (рус.). | Парные? | Расположение. |
| L3 | axillary | Подмышечные | + | Подмышка |
| L4 | brachial | Брахиальные. | + | Располагаются на двуглавой мышце, под грудной клеткой. |
| L2 | deep cervical | Глубокие шейные | + | Скрыты за слюнными железами. |
| L5 | inguinal | Паховые | + | Прикреплены к коже паха. |
| | lumbar | Поясничные. | + | Антериально по отношению к разветвлению брюшной аорты. |
| | mediastinal | Грудинные. | + | В области тимуса. |
| | mesenteric | Брыжеечные. | NO | Брыжейки тонкой кишки и поджелудочной железы. |
| L6 | popliteal | Подколенный. | + | За коленом, между приводящей и полумембранной мышцами. |
| | pyloric (pancreatic) | Поджелудочные. | + | Антериор по отношению к поджелудочной железе, рядом с привратником желудка |
| | renal | Почечные. | + | Между аортой и почками. |
| | sacral | Крестцовый. | NO | Постериально по отношению к разветвлению брюшной аорты. |
| | sciatic | Седалищные. | + | На спине, под седалищным нервом. |
| L1 | superficial cervical | Внешние шейные. | + | Антериор по отношению к слюнным железам. |
|
- если мышь - самка, причем беременная, кормящая или весьма упитанная - можно отделить молочные железы (mammary glands) /Mg/ (творожистая ткань в брюшном эпидермисе);
- отрезать нижнюю челюсть (разрезав мандибулярные соединения), срезать язык (tongue) /Ton/;
- отделить мозг:
- разрезать ножницами шею;
- отделить голову, оставшуюся тушку накрыть Saran-wrap, сверху насыпать лёд;
- снять с головы шерсть и выбросить, обычно при этой операции обнажаются находящиеся над глазами (Harderian gland) /Hg/.;
- острым пинцетом проделать ряд дырочек по средней линии черепа;
- пинцетом разломить черепную коробку на две половины (концы пинцета должны быть направлены вверх, чтобы не повредить мозг; следить, чтобы не оторвались слабо прикреплённые обонятельные доли);
- перевернуть череп, пинцетом помочь мозгу выскользнуть вниз;
- относительно легко отделяются:
- - обонятельные доли (olfactory lobes) /B-O/(лежат снаружи, проблем быть не должно);
- - большие полушария (cerebrium) /B-e/(аккуратно придерживая пинцетом за medulla поставить мозг на антериор часть, аккуратно отогнуть/расправить большие полушария, разорвать пинцетом (рвутся очень легко) нервы, соединяющие большие полушария с medulla;
- - (cerebellum) (отогнуть/расправить cerebellum (сбоку), разорвать пинцетом (рвутся очень легко) нервы, соединяющие cerebellum с medulla) /B-ll/;
- - (medulla) (остаток) /B-M/;
- аккуратно разрезать брюшную мышцу до грудины, вдоль рёбер и вдоль позвоночника (можно использовать как мышечную ткань);
- отделить мочеполовую систему (urogenital system):
если самец.
а) отделить тестикулы (testicle) /Tc/ (мешочки, содержащие тестикулы, нужно освободить от жира, вытянуть вместе с (epididymes), обрезать (vas deferens) - они соединяются с мочеиспускательным каналом (uretra) рядом с простатой);
б) отделить seminal vesicles /Sv/;
если самка.
освободить от жира матку (uterus) /Ut/ с яичниками (ovaries) /Ov/ и фаллопиевыми трубами (fallopian tube) ;
- отделить пищеварительную систему:
- отрезать как можно более постериор толстую кишку (colon). Аккуратно размотать кишки до желудка, при этом не лениться аккуратно отцеплять брыжейку;
Вн!!! отделение поджелудочной железы: кишка будет легко вытягиваться, пока дело не дойдёт до поджелудочной железы (рыжевато-коричневая), в этом же месте находятся поджелудочные лимфатические узлы, но их не увидеть - слишком мелкие;
При разматывании последовательно (с заду к переду) отделяются следующие зоны пищеварительной системы:
- - rectum;
- - нисходящая прямая кишка (descending colon) /Co/;
- - восходящая прямая кишка (ascending colon);
- - (cecum) (похожий на мешок);
- - (ileum);
- - тощая кишка (jejunum) /In/;
- - двенадцатиперстная кишка (duodenum);
- - желудок (stomach) /St/;
- - пищевод (esophagus);
- отделить селезёнку (spleen) /Spl/;
- отделить прямую кишку (colon) /Co/, промыть её снаружи и изнутри (шприцом) изотоническим раствором;
- отделить тонкую кишку (intestines) /In/ (отрезать от желудка по двенадцатиперстной кишке), промыть её снаружи и изнутри (шприцом) изотоническим раствором;
- обрезать пищевод над желудком (stomach) /St/ (отступив от него на 0.25-0.5mm), сполоснуть его снаружи, разрезать, вывернуть наизнанку, сполоснуть изнутри;
- отделить печень (liver) /Liv/:
- обрезать вену с грудной стороны печени;
- вытянуть (антериор) пищевод;
- отделить печень, вытащить из неё сгусток крови (если есть), сполоснуть в изотоническом растворе;
Вн!!! к медианной доле прикреплён желчный пузырь;
- отделить почки (kidney) /Kid/ с надпочечниками (!!!) (adrenal glands) /Ad/, снять оболочку (подсунув пинцет под оболочку в районе почечной лоханки); надпочечники обычно остаются прикреплёнными к оболочке (надпочечники самцов по размеру больше, чем надпочечники самок);
- отделить органы грудной клетки:
- вырезать грудину - приподнять её пинцетом, ножницами проткнуть диафрагму и разрезать до шейного кольца (концы ножниц приподнимать кверху, чтобы не повредить внутренние органы). Вн!!! Тимус /Ty/ часто остаётся прилепленным к грудине;
- зацепив за пищевод (esophagus) вытянуть лёгкие (lung) /Lg/ и прикреплённые к ним органы (обрезая ножницами соединение с позвоночником), отделить пищевод и трахею (trachea) от глотки как можно более антериор (чтобы не потерять щитовидные железы (thyroids);
Но!!! - вряд ли это имеет смысл, если мышь убита разрывом шейных позвонков);
- отделить (если требуется) щитовидную железу (рыжевато-коричневая, на антериор конце трахеи);
- отделить тимус (thymus) /Thy/ (прозрачный, расположен над/или вентрально по отношению к сердцу), у молодых мышей он относительно большой, но с возрастом уменьшается. Рядом с ним находятся два небольших грудинных лимфоузла (mediastinal lymph nodes), лучше их отделить (расположены дорсо-латерально по отношению к тимусу);
- отделить сердце (heart) /Ht/, разрезать, удалить кровь, сполоснуть;
|
