Очистка polyA+RNA (на колонке) | Практическая молекулярная биология

Комментарии.

Общие.

Принцип хроматографии: oligo(dT), ковалентно связанная с целлюлозой, образует ds-гибриды с polyA-хвостами mRNA при концентрации соли 0.5М. Эти гибриды дестабилизируются при прогреве в низкосолевом буфере.
После одного раунда хроматографии получается ~1-4% (в зависимости от источника) от исходного количества RNA, после второго раунда (~30-60% от первого) => 0.3-2.5% от исходного количества RNA.
С 0.1g колонки можно получить ~100µg poly(A)⁺RNA.
Одну колонку можно использовать более 10 раз.

По пунктам.

п.1-6.

oligo(dT) целлюлоза берётся из расчета: 1ml колонка на 10mg totalRNA.
Колонка должна быть по возможности широкой и короткой. Чем шире и короче колонка, тем быстрее скорость течения жидкости, а разделять хроматографические зоны при адсорбционной хроматографии не требуется.

п.8.

Этот нагрев денатурирует RNA, устраняя возможные двухцепочечные участки, которые могут сделать polyA-хвост недоступным.

п.9.

Если раствор будет слишком холодным, SDS из CLB выпадет в осадок в п. 11. растворить его в колонке чрезвычайно сложно. Придётся ее разбирать, нагревать суспензию oligo(dT) cellulose в большом объеме H₂O и перенабивать колонку заново.

п.11.

В некоторых методиках рекомендуется повторно наносить материал на колонку. Судя по нашему опыту это необязательно (в случае, когда использовалась 0.1g oligo(dT) cellulose и получено 30µg poly(A)⁺RNA нанесение элюата на колонку во второй раз не дало дополнительного связывания. (Т.е., когда нанесли на отдельную колонку то, что не связалось в первый раз, то при элюции пика не было.) Однако, нельзя исключить, что наш результат определялся высоким качеством используемой oligo(dT) cellulose (Type 7, Pharmacia).
Элюат можно собрать и приготовить из него рибосомный маркер молекулярного веса.

п.12.

Не надо ставить перед собой задачу отмывать до тех пор, пока спектрофотометр не перестанет детектировать пик RNA. В любом случае при одном раунде очистки на колонке останется масса рибосомной RNA, приблизительно равная массе mRNA (они как-то стехиометрически ассоциируют друг с другом).
Например, пусть на 0.1g колонке чистится ~ 2.5mg тотальной RNA. Ожидаемый выход mRNA составляет ~25-100µg. Приблизительно столько же будет и рибосомной RNA. Все это будет элюировано в объеме <0.7ml. Таким образом, нас устроит такая концентрация "C" примесей, что

0.7[ml]xC<<25-100µg => C<<30µg/ml, т.е. OD₂₆₀(элюируемого раствора) <<1.

п. 13.

На колонке с медным нагревателем оптимальное время подогрева 5' (при температуре воды в нагревателе 70^oC);
На рис. изображена колонка с подогревом. Вся конструкция скрепляется зажимом для бумаги - "бульдог" одетым на "шубу" из фольги.

п. 14.

Предварительный (до элюции) прогрев колонки и элюция горячим буфером приводят к тому, что RNA сходит пиком ширины ~1V_column, а не растягивается на ~5V_column (Для 0.5ml колонки при сборе фракций по 8-10 капель (~150 µl), polyA⁺RNA находится во 2-4 (реже в 5) пробирках. Достаточно снять ~7 пробирок.)

Фракции собираются:

9 капель
10
10
10
4 (на случай, если что-то попадет в 5^юфракцию, чтобы не брать слишком много дополнительного материала)
10
10.

п.15.

По 1 µl из каждой фракции к 100µl EB - измерять OD₂₆₀на спектрофотометре.

п.24.

При высоком рН двухцепочечные нуклеиновые кислоты денатурируют. Такая отмывка гарантирует, что все, что способно гибридизоваться с oligo(dT) будет смыто с колонки.

> Методы > РНК > Очистка polyA⁺ RNA. Очистка polyA⁺ RNA (на колонке).		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
Приготовление колонки. Хроматография. Осаждение. Регенерация колонки. Растворы. CLB EB Комментарии. Общие. По пунктам.	По нашему опыту основным преимуществом хроматографической очистки перед седиментационными методами является больший выход высокомолекулярной mRNA (особенно опасен в этом отношении метод, связанный с гибридизацией mRNA c Bio(dT)_12-20 с последующей адсорбцией на стрептавидин-парамагнитные частицы - в наших руках он давал приличный выход лишь до ~3kb).
Приготовление колонки. суспензировать соответствующее количество oligo (dT) cellulose в стерильной H₂O (1g -> 2.5-3.5ml); декантировать по крайней мере дважды (например, для 0.1g oligo(dT) cellulose => ресуспензировать в ~12ml H₂O в 15ml ЦФ-пробирке, дать осесть под действием силы тяжести ~10', снять надосадочную жидкость, повторить); заполнить колонку: * вылить суспензию в колонку в 1xCLB (в нём пузырьки воздуха легче проходят сквозь штифт); * дать стечь так чтобы ~1/2 колонки осталась заполненной; ввести верхний штифт (либо перевернутым желтым типом, либо обрезанной 1ml пипеткой); сполоснуть ~3V_column 0.1М NaOH; промывать 1^xCLB до тех пор, пока pH элюата не будет в районе 8.0 (~5V_column). Хроматография. растворить RNA в стерильной H₂O; 65-70^oC, 5'; быстро охладить в водяной бане до NT (но не ниже!!! ); добавить равный объём 2^ХCLB; нанести на колонку; сполоснуть 5-10V_column 1^xCLB, (не обязательно => спектрофотометрически проконтролировать, что RNA смыта); прогреть колонку 70^oС, 5'; элюировать poly(A)⁺RNA ~2V_column EB, 70^oC (собирать фракции по 1/5-1/4V_column); проанализировать А₂₆₀, объединить фракции, содержащие mRNA. (обычно не нужно) после одного раунда очистки количество poly(A)⁺RNA~50%, вторая очистка способна довести чистоту до ~90%. переуравновесить колонку 1^xCLB (щелочью не споласкивать); нагреть элюат до 65-70^oC, 5'; быстро охладить до NT, довести концентрацию NaCl до 0.5М (+1/10V 5M NaCl) и провести вторую хроматографию. Осаждение. добавить 1/10V AcONa, 3M pH 5.2, 2.5V EtOH 96%; -20^oC, 1h-(лучше ON); ЦФ (лучше высокоскоростное), 4^oС, 15-20'; сполоснуть осадок 70% EtOH; растворить в H₂O (получается 90-110% от количества, определенного спектрофотометрически после элюции). Регенерация колонки. сполоснуть колонку ~5V_column0.1М NaOH; промыть: используется немедленно: промывать 1^xCLB до тех пор, пока pH элюата не будет в районе 8.0 (5-10V_column), использовать не сразу: уравновесить 0.5М NaCl хранить при +4^oC; долговременное хранение: сполоснуть 50% EtOH, сушить под вакуумом, хранить при -20^oC.