- к ~0.8g мух, растёртых в жидком азоте добавить 3.5ml GTC;
- залить жидким азотом, растереть в порошок;
- смешать (и заодно раздробить DNA) несколько (3-4) раз пропустив лизат через ~19G иглу;
- добавить Sarcosile до 0.5% (175µl 10%), смешать;
- ЦФ >5krpm, NT, 10';
- супернатант наслоить на 9.7ml CsCl/EDTA в ультрацентрифужной пробирке;
- ЦФ 32krpm, NT, 24h (SW41);
- срезать дно пробирки, сполоснуть 70%EtOH, подсушить NT;
- растворить в 150µl:
TE (pH7.6), SDS 0.1%;
- дополнительно сполоснуть дно 125µl, объединить;
- Ф:Х, Х;
- добавить
AcNa, 3M pH 5.2 1/10V => 30µl,
EtOH 2.5V => 750µl; осадить;
- сполоснуть осадок 70% EtOH;
- растворить в H2O(RNase free), хранить при -70oС.
Вариант дляTLS-55.
- к ~0.1g мух, растёртых в жидком азоте добавить 0.5ml GTC;
- залить жидким азотом, растереть в порошок;
- смешать (и заодно раздробить DNA) несколько (3-4) раз пропустив лизат через ~19G иглу;
- добавить Sarcosile до 0.5% (25µl 10%), смешать;
- ЦФ NT, 10';
- супернатант наслоить на 1.7ml CsCl/EDTA в ультрацентрифужной пробирке;
- ЦФ 42krpm, NT, >10h (TLS-55);
- срезать дно пробирки, сполоснуть 70%EtOH, подсушить NT;
- растворить в 100 + 35µl:
TE (pH7.6), SDS 0.1%;
- Ф:Х, Х;
- добавить
AcNa, 3M pH 5.2 1/10V => 15µl,
EtOH 2.5V => 380µl; осадить;
- сполоснуть осадок 70% EtOH;
- растворить в H2O(RNase free), хранить при -70oС.
|