Практическая Молекулярная Биология - главная страница.
 > Методы > РНК > Синтез in vitro.

Синтез RNA in vitro.


Главная.
Новости.
О проекте.
Справочник.
Рестриктазы.
Методы.
Растворы.
Расчёты.
Обзоры.
Обучение.
Ссылки.
Скачать сайт.

Образовательные
ресурсы.

Растворы.
5x Transcription buffer
5x NTP mix
Комментарии.
Общие.
По пунктам.
Метод для синтеза RNA in vitro прямо на неочищенной PCR смеси.
Владимир Антоненко. Пущино, Институт Белка РАН, группа генной инженерии.

  1. составить смесь:
    2. Конц.Сток100µl
    DNA (неочищенный PCR-продукт)10-20µg/ml0.1-0.2µg/µl10µl
    Transcription buffer1x5x20µl
    NTP mix1x5x20µl
    Inorganic pyrophosphatase*10u/ml???1u
    BSA0.1mg/ml10mg/ml1µl
    Спермидин2mM100mМ2µl
    RNasin (RNAguardTM, Boehringer)500u/ml???50u
    T7 RNA полимераза5u/µl???500u
    H2O mQ  
  2. инкубировать 37oC, 2h;
  3. объем реакционной смеси довести до 200µl mQ, экстрагировать 1/2V кислого фенола, встряхивать 1-2', ЦФ >4krpm, NT, 5';
  4. экстрагировать 1/2V фенол/хлороформ (1:1), ЦФ >4krpm, NT, 5';
  5. добавить 125µl 8M LiCl (т. е. довести до 3М), 30' на льду, ЦФ 14krpm, NT, 5';
  6. осадок растворить в 140µl mQ, добавить

    7. 70µl 7.5М AcNH4 (1/2V),
    3V этанола;

  7. инкубировать при -70oC, 1h, ЦФ 14krpm, NT, 10';
  8. осадок промыть 2 раза 80%, 1 раз 95% этанолом, растворить в mQ;
  9. хранить при -70oC, желательно по аликвотам.

    Растворы.

    5x Transcription buffer

    (хранить при -20oС):

    Конц.Сток10ml50ml
    Hepes-KOH, pH 7.6600mM1M6.0ml30.0ml
    MgCl2100mM1M1.0ml5.0ml
    DTT100mM1M1.0ml5.0ml
    H2O mQ2.0ml10.0ml

    5x NTP mix

    (хранить при -20oС):

    Конц.Сток100µl2.0ml
    ATP20mM100mM20µl0.4ml
    GTP20mM100mM20µl0.4ml
    CTP20mM100mM20µl0.4ml
    UTP20mM100mM20µl0.4ml
    H2O mQ20µl0.4ml


    Комментарии.

    Общие.

  • С помощью данной методики получали транскрипты с PCR-фрагментов для трансляции в бесклеточных системах, где необходимы большие количества RNA. В моей практике из 100µl реакционной смеси получается примерно 200-300µg RNA.
  • Т7 промотор становится более активным если на его 5'-конце есть 3-4 дополнительных нуклеотида, и если после промотора есть 1-2 "G".

    • По пунктам.

    п. 1.

  • * Пирофосфатаза хотя и увеличивает выход RNA, но незначительно, а по количеству выпавшего пирофосфата можно судить о интенсивности транскрипции. Избавиться от него легко центрифугированием 8krpm, 1'.

    • п. 2.

  • Активность T7 полимеразы максимальна при 42oC. Хотя и считается, что при повышенных температурах выход укороченных продуктов увеличивается, иногда в целях увеличения выхода RNA, реакцию целесообразнее проводить именно при 42oC.

    • п. 3.

  • DNA уходит из водной фазы.

    • п. 5.

  • Избирательное осаждение RNA.

    • п. 8.

  • Отмывку лучше проводить этанолом комнатной температуры - происходит лучшее освобождение от солей.

"Практическая Молекулярная Биология" http://molbiol.edu.ru
e-mail: pmb@molbiol.edu.ru


Rambler's Top100

Hosted by uCoz