Приготовление геномной библиотеки | Практическая молекулярная биология

Комментарии.

Общие.

Оценить необходимый размер библиотеки для известного размера генома (см. "Свойства и состав живых организмов.") можно по формуле:

N = ln(1-p)/ln(1-l_фр/L), где

N – размер библиотеки;
p – вероятность, что уникальный фрагмент будет присутствовать в библиотеке;
l_фр – средний размер клонируемого фрагмента;
L – размер гаплоидного генома.

Для дрозофилы при клонировании в фаге лямбда: l_фр=1.5x10⁴bp; L=1.4x10⁸bp =>

N=-9.3х10³ln(1-p)

p	0.75	0.9	0.999	0.99999
N (x10⁴)	1.2	2.1	6.4	10.7

Среднее количество клонов, которое получается при скрининге библиотеки "точечным" зондом: n = N l_фр/ L; для дрозофилы: n ~10^-4N.
Нужно иметь в виду, что представленные выше вероятности рассчитывались в предположении, что "Sau3A недорез" происходит равномерно. В реальном геноме имеются участки аномально высокой и аномально низкой плотностью Sau3A сайтов.

По пунктам.

п. 1.

На качестве фореза (особенно при такой низкой концентрации агарозы) может сильно сказаться "перегруженность" ячейки, поэтому имеет смысл гнать несколько дорожек с разным количеством DNA.
Особенности работы с низкопроцентными (0.3%) гелями:

в плашку для электрофореза залить "подложку" - слой агарозы 1.5-2.0% толщиной ~2-3 mm, дать застыть;
на этой подложке закрепить гребенку так, чтобы между зубцами и подложкой было расстояние 1-2mm;
залить 0.3% агарозу (лучше в холодной комнате);
гребенку удалять только под слоем буфера, иначе ячейки слипнутся.

ВНИМАНИЕ! Работать в холодной комнате. Гель очень хрупкий, все манипуляции проводить только вместе с 2% подложкой; не лить буфер на поверхность геля.

п. 2-8.

В этом разделе определяется количество Sau3A, которое за 1h при 37^oС дает максимальное количество фрагментов в диапазоне 14-20kbp’s. Для ориентировки - у нас получалось ~0.015-0.03u на 0.75µl DNA.

п. 2.

0^oС - чтобы рестрикция в различных пробирках шла одно и то же время.

п. 4.

Приготовление двукратных разведений фермента. Геномная DNA весьма вязкая, хорошо перемешать фермент непросто. В то же время, если смешивать слишком интенсивно, можно раздробить DNA. Разумный компромисс - смешивать и в начале и в ходе инкубации на 37^oС)

п. 6.

Остановка рестрикции. Буфер для внесения не должен содержать ксиленцианол, иначе он, находясь в пределах 14-20kb, будет мешать анализу.

п. 9.

Сайты рестриктазы Sau3A расположены в среднем через 250bp. Однако, существуют зоны, где их аномально много или аномально мало. Чтобы такие зоны не избежали клонирования, применяются рестрикции с заниженной (соответственно - завышенной) концентрацией рестриктазы.
Стоит обратить внимание, что равномерно смешать фермент с DNA трудно, поэтому вначале нужно развести необходимое количество фермента в 1х М буфере в объеме ~ 1/5 суммарного объема рестрикции и только затем смешивать его с DNA. Стоит дополнительно помешивать пробирку во время инкубации на 37^oС каждые 10-15'.

п. 10.

Обычно оказывается, что рестриктазы взято больше, чем нужно и приходится ставить реакцию "1/3" в новых условиях (вполне вероятно, что стоит сразу ставить четыре рестрикции).

п. 11.

Импортные мешалка и перистальтический насос (иначе раствор будет идти толчками), не забыть предварительно протолкнуть воздушный пузырек в смесителе.
Мы предпочитаем наслаивать градиент сверху. Чтобы не нарушать градиент, можно положить в пробирку маленький кусочек пробки и наносить раствор на него.
Смешиваемые растворы имеют различную плотность, поэтому равные объёмы в смеситель не нальёшь. Если вы хотите, чтобы после открывания крана смесителя растворы остались в равновесии, надо наливать (для ультрацентрифужной пробирки объёмом V_o):

V₂₅ = V_o/(1+p₂₅/p₅) = 0.471V_o = 5.65ml для V_o = 12ml
V₅ = V_o/(1+p₅/p₂₅) = 0.529V_o = 6.35ml для V_o = 12ml

п. 13.

Уравновешивать пробирки, добавляя 1х М буфер.

п. 18.

Осаждать (и анализировать) можно не все фракции, а через одну (две).

п. 20.

Мы проводим упаковку следующим образом:

заранее подготовить клетки;
утром упаковать DNA;
высеять 10х разведения для определения титра библиотеки;
через 6-7h, когда появятся фаговые бляшки, рассчитать титр;
к остаткам библиотеки добавить DMSO до 7%, расфасовать по 10⁶pfu аликвотам (для дрозофилы), подписать и заморозить (весьма распространенно беспокойство по поводу качества DMSO, длительное время хранившегося при NT. Мы убеждены, что, если речь идет о хранении замороженных клеток, то беспокоится не о чем).
высеять необходимое количество;

п. 22.

Не надо откладывать заморозку библиотеки. Через неделю титр может упасть раз в десять.
Подписывать аликвоты (вектор, источник библиотеки, дата, титр) надо очень аккуратно, т.к. хорошая библиотека может пригодится и через год и через 5 лет.

> Методы > Библиотеки > Геномная библиотека. Приготовление геномной библиотеки.		Главная. Новости. О проекте. Справочник. Рестриктазы. Методы. Растворы. Расчёты. Обзоры. Обучение. Ссылки. Скачать сайт. Образовательные ресурсы.
Проверка качества DNA. Аналитический недорестрикт. Препаративный недорестрикт. Фракционирование ДНК. Растворы. NE-5 NE-25 Комментарии. Общие. По пунктам.
Проверка качества DNA. форез в 0.3% агарозе (лучше в холодной комнате). Маркер - лигированный на себя фаг лямбда. Подходящая для конструирования библиотеки DNA должна идти достаточно компактным бэндом выше ~100kbp. Шмера быть не должно. Аналитический недорестрикт. приготовить 9 пробирок "N1"-"N9" в бане 0^oС (из расчета ~0.75µg ДНК на пробирку); общая смесь 166.7µl (7.5µg DNA в 1х "M" рестрикционном буфере), разаликвотить: N1=30µl, N2=15µl, .............. N9=15µl, N10=15µl; рестриктазу Sau 3A развести до концентрации 0.5u/µl в 1х "M" буфере (V~5µl); добавить к "N1" 4µl разведённого фермента, пипетировать ~10 раз обрезанным желтым типом. 1/2 материала перенести в следующую пробирку, следующий шаг - новым типом и т.д. в 10^ю пробирку ничего переносить не надо, она будет служить контролем "без рестриктазы" (9 пробирок обрабатываются за ~10'); 37^oС, 1h, слегка помешивая каждые 10-15'; + 1.5µl буфера для внесения SDS⁽⁺⁾; форез (0.3% агароза) (лучше в холодной комнате); рассчитать концентрацию фермента, при которой максимальное количество DNA имеет длину 14-24kbp. Препаративный недорестрикт. препаративная рестрикция 3х по 100µg DNA резать в условиях "1" - 3^х кратная оптимальная концентрация рестриктазы, "2" - 1^х, "3" - 1/3^х форез - контроль каждой фракции; если рестрикция прошла удачно - объединить, если "промахнулись" - взять только удачные; поставить дополнительные (уже скорректированные) препаративные рестрикции. Фракционирование ДНК. в пробирке ротора SW40 приготовить градиент 25->5% NaCl (w/v) 3mM EDTA, pH 8.0; наслоить DNA в объеме <200µl (но не более 150µg); ЦФ 37 krpm NT, 4.5h; разгонять при низком ускорении, останавливать центрифугу в режиме без торможения; перенести фракции по 250µl в пробирки с 1.25ml 77% EtOH; >1h, -20^oC; ЦФ NT, 10'; осадок дважды промыть охлаждённым 70% EtOH; 1/20 материала на форез (0.3% агароза), выбрать пробирки, содержащие фрагменты DNA длиной 14-24kbp (нужный диапазон размеров обычно находится в районе 14-16^ойпробирок); объединить содержимое нужных пробирок; определить концентрацию, упаковать аликвоту; определить титр библиотеки (высеяв 1µl, 10^-2µl, 10^-4µl); добавить DMSO до 7%, разаликвотить в подписанные пробирки по 10⁵pfu (для дрозофилы), хранить при –70^oС.