Скрининг фаговой библиотеки | Практическая молекулярная биология

Комментарии.

По пунктам.

п. 1.

Или 37^oC - не долго, чтобы не доводить до насыщения.
Для первичного высева лучше использовать, если это возможно, клетки, обеспечивающие селекцию против вектора без вставки.

п. 2.

Чашки прогреваются для того, чтобы не было проблем, связанных с преждевременным застыванием верхнего агара.
Для чашек используется LТВ агар, т.к. использование бедной среды уменьшает размер бляшек.
Очень важно заливать чашки и разливать верхний агар на строго горизонтальной поверхности, иначе плотность высева будет очень неравномерной. или, если уж приходится делать это на не выровненной поверхности, то чашки должны находиться в одном и том же положении - для контроля надо сделать отметки на бортиках.

п. 3.

Однажды у нас была банка с бакто-агаром, который начинал застывать при 47^oС. Выход из этой ситуации - сменить агар, а тот, который застывает, использовать для приготовления нижнего агара.

п. 5.

Адсорбция фага лямбда на клетки, проникновение внутрь. Превышение времени инкубации чревато тем, что какой-нибудь фаг лизирует клетку и успеет размножиться. В некоторых методиках для синхронизации заражения, клетки с фагом держат без встряхивания при 0^oC 25' - адсорбция, а затем при 37^oC 5' - проникновение.

п. 8.

Чтобы агар стал более твердым и мембрана не прилипла. Попытка заменить {1h при 4^oС} на {5' при -20^oC} приведёт к тому, что поверхность агара станет мокрой.

п. 10.

На самом деле важно только, чтобы мембраны расположились на чашках одинаковым образом (это существенно упрощает последующий анализ автографов). Накладывать мембрану выгнув, последовательно от центра к краям.

п. 12.

Проколы делаются для того, чтобы потом сориентировать сигнал на автографе относительно чашки. Т.к. мембрана после гибридизации слегка меняет размер, для такой ориентации особое значение имеют проколы ближайшие к сигналу. Нанесение проколов равномерно по площади гарантирует, что для любой точки чашки ближайшие проколы окажутся не слишком далеко.
"Вертикальность проколов". Мембрана ложится на агар, а автограф будет приложен ко дну чашки. Чтобы соответствие было аккуратным, проколы должны быть вертикальными.

п. 13.

Если поступить наоборот и брать пинцетом сторону, которая дальше всего отстоит от бортика чашки, то мембрана зацепится за бортики своими краями и "скользнёт" по поверхности агара (это может привести к разрушению слоя верхнего агара).

п.25-29.

На вторичный скрининг лучше использовать нитроцеллюлозные мембраны - они дешевле. При этом так же можно пользоваться UV-пришивкой (хотя во многих руководствах утверждается, что нельзя).
Мы используем для вторичного скрининга тот же гибридизационный буфер с меткой, что был использован для первичного (предгибридизационный буфер – свежий, а "старый" гибридизационный надо перед внесением прогреть ~3' в кипящей бане; его можно даже сохранить для картирования фагов).

п. 28.

Контрольный высев (1/2x10⁵ часть бляшки) проводиться только для определения титра фага. Если используются чашки с нижним агаром диаметром 150mm, то на одной чашке умещается ~40 "капель-титров" верхнего агара.