> Методы > Библиотеки > Анализ клонов после первичного скрининга.
PCR-гибридизация первичного скрининга cDNA библиотеки.
Главная.
Новости.
О проекте.
Справочник.
Рестриктазы.
Методы.
Растворы.
Расчёты.
Обзоры.
Обучение.
Ссылки.
Скачать сайт.
Образовательные
ресурсы.
PCR-гибридизация после первичного скрининга позволяет:
а) отличить истинно-позитивные сигналы от ложно-позитивных,
б) оценить размер вставки индивидуальных клонов.
а) отличить истинно-позитивные сигналы от ложно-позитивных,
б) оценить размер вставки индивидуальных клонов.
- выколоть зоны локализации сигналов;
- перенести их в 1.7ml микроцентрифужные пробирки, с SM/хлороформ = 500 µl/20 µl;
- элюция фага 2h на качалке 37oС или в холодильнике ON (суспензию фага хранить при 4oС);
- PCR амплификация в объёме 15 µl:
- суспензию фага из п.3 ЦФ 5' NT;
- в каждую PCR-пробирку добавить по 1 µl суспензии фага;
- параметры PCR:
- нанести PCR-реакции на 1% агарозный гель;
- Саузерн-блот;
- гибридизация.
I. Td = 95oC, => 1';
II. 28 циклов:
Td = 94oC, => 10'';
Ta = 48.5oC, => 25''
Te = 68oC, => 3-6';
III. T = 4oC;
