Комментарии.
Общие.
- Чувствительность ~0.1-1.0ng белка на бэнд.
- Метод весьма чувствителен, поэтому необходимо:
* работать только в перчатках;
* качество воды очень критично, на всех этапах использовать только mQ.
- нельзя использовать b-MeEtOH в качестве агента, восстанавливающего дисульфидные связи: он вызывает появление двух артефактных полос в районе 50 и 67kDa.
- серебряное окрашивание мешает экспозиции3H - изотопов.
- сообщалось о возможности повысить чувствительность метода в 2-9/40-50 раз с помощью двойного окрашивания: предварительное окрашивание Coomassie Blue (нормальная/колоидная форма), а затем - серебряное окрашивание.
- Вещества, влияющие на окрашивание:
SDS
Глицин
Tris
Мочевина
Глицерин
Уксусная кислота
Белки - вызывают сильное фоновое окрашивание
По пунктам.
п. 6.
- К NH4(35%) добавить 0.1M NaOH, затем, перемешивая, понемногу добавлять AgNO3. Когда выпадет коричневый осадок, растворить добавлением минимального количества NH4. Довести объем до 100 ml H2O. Раствор нестабилен, должен быть использован в течение 5'. окрашивание проводится только в перчатках.
п. 8.
- После 10' существенно возрастает фон.
- Проявление продолжается ещё 2-4' после удаления геля из проявителя.
|
