- перенос 25', выставив ограничение по току Amax=2mA/cm2(например, для геля размером 10х10cm2xAmax=200mA).
после переноса
- снять крышку, верхние куски Whatman, отметить на фильтре сторону, на которую шел перенос (сторона P);
- сполоснуть фильтр в 1хPBS, хранить:
* ON при NT (сухим, завернутым в фильтровалку);
* по крайней мере 2 недели при +4oC (влажным, завёрнутым в SaranWrap или в ванночке с PBS);
- пластины прибора после переноса промокнуть фильтровалкой, сполоснуть дистиллированной водой из промывалки, вытереть полотенцем. Дать высохнуть, закрыть;
Окрашивание белков на фильтре.
- после переноса белки на мембране можно окрасить (лишь окрашивание Ponceau S обратимо и полностью совместимо с со всеми методами иммуноокрашивания);
Характеристики белковых красителей.
Способ окраски | * | NC | N | P | Окрашивание |
Ponceau S | 1-2µg | + | - | + | обратимое |
Amido Black | 1.5µg | + | - | + | постоянное, низкий фон |
Comassie blue | 1.5µg | + | - | + | постоянное, высокий фон |
India ink | 100ng | + | - | + | постоянное |
Biotin-avidin | 30ng | + | + | + | постоянное, бледнеет со временем |
Colloidal gold | 3ng | + | - | + | постоянное |
|
* - Чувствительность
NC - Нитроцеллюлоза
N - Нейлон
P - PVDF
- если мембрана была высушена - аккуратно положить её на поверхность H2O, дать промокнуть под действием капиллярных сил и утопить на 3-5';
- перенести в окрашивающий раствор PSS, 5-10' с покачиванием;
- после появления картинки сполоснуть мембрану в нескольких сменах H2O;
- положение маркера отметить водоустойчивыми чернилами/карандашом.
Гибридизация.
- забивка в HB на качалке 40' NT (или +4oС ON);
- гибридизация с "I"а/т в HB в гибридайзере 2h 26oC (или +4oС ON);
- заморозить раствор для I-гибридизации;
- отмывка 3х 5' в WB на качалке NT;
- гибридизация со "II"а/т в HB в гибридайзере 30-50' 26oC;
- заморозить раствор для II-гибридизации;
- отмывка, как в п.19.
Проявление Westerna (ECL-kit).
- мембрану вынуть из отмывочного раствора, промокнуть на фильтровалке, положить на Saran Wrap (сторона Р - вверх);
- смешать равные объёмы растворов 1 и 2 (приблизительно по 0.5-1.0ml, в зависимости от размера фильтра), нанести на фильтр (можно пульверизатором);
- 1' NT (следить, чтобы был покрыт весь фильтр);
- если раствора много, приподнять фильтр, дать лишней жидкости стечь с угла;
- а) Если свежие ECL реагенты и хорошие а/т:
* подготовить заранее пленку, кассету, фиксаж и проявитель;
* мембрану положить на стекло, стороной Р вверх, сверху покрыть Saran Wrap, отнести в темную комнату, положить на стол.;
* рентгеновскую плёнку наложить сверху, прижать; сделать несколько экспозиций: 5'', 30'', 60''; проявить; оценить автограф, если слишком сильный или слабый, повторить экспозицию, но уже с откорректированным временем.
б) Если ECL реагенты старые и/или плохие а/т:
в этом случае требуется большое время экспозиции, поэтому:
* фильтр завернуть в Saran Wrap, заложить на экспозицию в кассете на 3';
* перезаложить (на вторую плёнку);
* первую пленку проявить, по ней оценить, сколько времени нужно экспонировать вторую (но >30' бессмысленно).
Хранение фильтра после проявления.
- Хранить влажными (в 1хPBS):
(1) +4oС на стекле, покрытым Saran Wrap, до 2-3 недель;
(2) +4oС в растворе 1х PBS, до 1-2 недель - пока не прорастёт;
(3) +4oС в растворе 1х PBS + 0.005%NaN3, >4 месяцев;
(4) долговременное хранение: завернуть в Saran Wrap, запаять в полиэтиленовый пакет, (optional - проложить между стёклами), хранить на -70oС.
Отшпаривание от а/т для повторной гибридизации.
Не всегда нужно, т.к. обычно и без него можно разобраться.
(и для NC, и для PVDF):
- 30' 50oС в SB;
- сполоснуть фильтр 1хPBS.
Хранение а/т.
На этот счет существуют разные мнения:
- Некоторые замораживают в жидком азоте небольшие аликвотами, хранят на -70oС, размораживают 1 раз и далее хранят при +4oС. По нашему опыту на +4oС лучше не хранить более месяца.
- Другие хранят на -20oС, размораживают и замораживают при каждом использовании.
- На некоторые фирменных а/т есть указания как с ними обращаться. Но в любом случае слишком большие фасовки лучше разаликвотить и часть заморозить.